Łódź, 27.10.2009r.

LABORATORIUM Z TECHNOLOGII REMEDIACJI

„Biodegradacja skleroprotein”

Kierunek: Ochrona środowiska

Rok: IV

Grupa: III

Środa 12¹⁵-16⁰⁰

Borkiet Joanna

Buczyńska Marcelina

Broszczyk Agata

1. Wstęp teoretyczny

Skleroproteiny to białka strukturalne o budowie włókienkowej ( fibrylarne), stanowiące główny składnik tkanki podporowej u wyższych organizmów. Są to białka nierozpuszczalne, odporne na działanie enzymów proteolitycznych.

Do skleroprotein zalicza się: keratynę, elastynę i kolagen. Te pierwsze tworzą zewnętrzną warstwę skóry jak: włosy, paznokcie, pióra, sierść, rogi, kopyta (tak zwane przydatki skóry). Elastyna i kolagen to białka charakteryzujące się dużą sprężystością stąd występują w mięśniach, ścięgnach, wiązadłach i głębszych warstwach skóry.

W przemyśle spożywczym wymienione białka, a w szczególności keratyny stanowią podstawowy składnik odpadowy, ze względu na wysoką odporność enzymatyczną i chemiczną, nie są utylizowane przez organizmy zwierzęce co stanowi duży problem związany z gromadzeniem w dużych ilościach jako produkt uboczny. Problem ich zagospodarowania można rozwiązać wykorzystując istniejące w przyrodzie mikroorganizmy, które wyposażone są w kompleksy enzymów zdolnych do rozkładu tych białek. Keratynolityczną aktywność wykazują bytujące w glebie keratynofilne grzyby, niektóre szczepy promieniowców (Streptomyces) i bakterii. Wykorzystanie preparatów enzymatycznych pozyskiwanych z tych drobnoustrojów i zastosowanie ich na skalę przemysłową mogłoby stanowić bardziej efektywną metodę utylizacji odpadów zawierających skleroproteiny.

2. Cele i wykonanie ćwiczenia

1. Celem było zbadanie degradacji enzymatycznej dwóch substratów: piór i mączki keratynowej - rozdrobnione kopyta, zbadanie aktywności preparatu pozakomórkowego Streptomyces fradiae wobec tych substratów. Metoda ta polegała na pomiarze przyrostu uwolnionego, rozpuszczalnego białka.

Próba właściwa - zawierała substrat (200mg rozdrobnionych piór, kopyt); 5 ml 25mM buforu boranowego; 0,5 ml 1mM r-ru MgCl₂; 3,5 ml H₂O, 1ml preparatu enzymatycznego. Po 2 godzinnej inkubacji w temperaturze 37^oC została przesączona i otrzymaliśmy filtrat.

Próba kontrolna - zawierała wszystkie te same składniki z wyjątkiem enzymu, który uprzednio został inaktywowany.

Filtrat pozyskany z: piór rozcieńczono 5-krotnie, z mączki keratynowej 10-krotnie. Zawartość białka oznaczono metodą Lowryego. Wyniki przedstawiono w tabeli nr 3 i 4.

2. Celem było zbadanie degradacji enzymatycznej elastyny.

• Oznaczono aktywność preparatu enzymatycznego wobec elastyny barwionej czerwienia Congo.

Próba właściwa - zawierała substrat (1,5 ml 0,2% zawiesiny elastyny w 0,05 M buforze boranowym); 1,5 ml r-ru enzymatycznego. Po 10min inkubacji w temperaturze 30^oC, a następnie 5min we wrzącej łaźni wodnej została odwirowana w wirówce. Następnie została zmierzona absorbancja cieczy nadoosadowej przy λ = 495 nm

Próba kontrolna - Została przygotowana w identyczny sposób z wyjątkiem enzymu, który zastąpiono uprzednio inaktywowanym enzymem. Wyniki przedstawiono w tabeli nr 1.

• Oznaczono aktywność enzymatyczną poprzez pomiar ilości uwolnionego z substratu rozpuszczalnego białka.

Próba właściwa - zawierała substrat ( 20 mg elastyny w 2 ml 0,05 M buforu boranowego); 1,5 ml r-ru enzymatycznego; 3,5 ml H₂O, 1ml preparatu enzymatycznego. Po 10min inkubacji w temperaturze 30^oC, a następnie 5min we wrzącej łaźni wodnej została przesączona i otrzymaliśmy filtrat. Oznaczaliśmy białko metodą Lowryego.

Próba kontrolna - Została przygotowana w identyczny sposób z wyjątkiem enzymu, który zastąpiono uprzednio inaktywowanym enzymem. Wyniki przedstawiono w tabeli nr 2.

3. Wyniki i obliczenia.

Tabela nr 1

Elastyna Congo red 10 min, 30^oC, λ 495
Numer próby	Ek λ 495	Ewł λ 495	ΔE495
1	0,43	0,71	0,2144
2	0,31	0,63
3	0,32	0,54
4	0,37	0,51
5	0,49	0,64
6	0,43	0,65
7	0,5	0,54
8	0,215	0,56
średnia	0,3831	0,5975

Obliczenia:

∆E₄₉₅ = E_{wł śr} - E_{k śr}

∆E_{495 =} 0,5975 - 0,3831 = 0,2144

Tabela nr 2

Elastyna 10 min, 30^oC, λ 650
Numer próby	Ek λ 650	Ewł λ 650	ΔE650	Ilość uwolnionego białka µg białka/ml
								Po t = 10 min	Po t = 60 min
1		0,39		0,3663	146,52	879,12
2	0,145	0,41
3		0,37
4		0,44
5		0,45
6	0,04	0,40
7		0,40
8		0,39
średnia	0,04	0,4063

Obliczenia:

Wiedząc, że:

Dla E₆₅₀ 0,1 40 µg białka/ml

∆ E₆₅₀ = E_{wł śr} - E_{k śr}

∆ E₆₅₀ = 0,4063 - 0,04 = 0,3663

0,1 - 40 µg białka/ml

0,3663 - X µg białka/ml

X = 146,52 µg białka/ml po t = 10 min

Teoretycznie, gdy proces trwałby 60 min

X = 146,52 · 6 = 879,12 µg białka/ml

Tabela nr 3

Pióra 1:5, λ 650
Numer próby	Ewł	Ek	ΔE650	Ilość uwolnionego białka µg białka/ml
1	0,14	0,01	0,14	280
2	0,15	0,01
3	0,16
4	0,03
średnia	0,15	0,01

Obliczenia:

Dla E₆₅₀ 0,1 40 µg białka/ml

∆ E₆₅₀ = E_{wł śr} - E_{k śr}

∆ E₆₅₀ = 0,15 - 0,01 = 0,14

0,1 - 40 µg białka/ml

0,14 - X µg białka/ml

X = 56 µg białka/ml

Po uwzględnieniu 5 - krotnego rozcięczenia

X = 56 · 5 = 280 µg białka/ml

Tabela nr 4

Kopyta 1:10, λ 650
Numer próby	Ek	Ewł	ΔE650	Ilość uwolnionego białka µg białka/ml
1		0,31	0,2125	850
2	0,12	0,31
3		0,36
4		0,35
średnia	0,12	0,3325

Obliczenia:

Dla E₆₅₀ 0,1 40 µg białka/ml

∆ E₆₅₀ = E_{wł śr} - E_{k śr}

∆ E₆₅₀ = 0,3325 - 0,12 = 0,2125

0,1 - 40 µg białka/ml

0,2125 - X µg białka/ml

X = 85 µg białka/ml

Po uwzględnieniu 10 - krotnego rozcięczenia

X = 85 · 10 = 850 µg białka/ml

4. Wnioski

Z otrzymanych wyników prób kontrolnych i właściwych zauważamy, że już po 10 min preparat enzymatyczny przyczynił się do zwiększenia absorbancji. Wzrost absorbancji jest proporcjonalny do ilości użytego roztworu enzymaycznego. Przy oznaczaniu aktywności enzymatycznej poprzez pomiar ilości uwolnionego z substratu rozpuszczalnego białka zauważamy również, że ilość uwalnianego białka rośnie wraz ze wzrostem czasu inkubacji.

8

---