ENZYMY - 3

1. Badanie aktywności proteaz

Proteazy, czyli enzymy proteolityczne (ściślej hydrolazy peptydów), kata­lizują rozkład białek przez hydrolizę wiązań peptydowych. Są białkami prostymi i zazwyczaj do przejawiania właściwości katalitycznych nie wymagają dodawania kofaktorów. Enzymy proteolityczne nie wykazują zbyt ścisłej specyficzności substratowej, natomiast wykazują wybiórczość w stosun­ku do położenia rozkładanego wiązania w łańcuchu polipeptydowym.

W związku z tym proteazy dzielimy na:

1. hydrolazy peptydylo-peptydowe (endopeptydazy), rozszczepiające wiązania peptydowe znajdujące się wewnątrz łańcucha białka; produktami ich dzia­łania są peptydy

2. hydrolazy peptydylo-aminokwasów (karboksypeptydazy)

3. hydrolazy α-aminoacylo-aminokwasów (aminopeptydazy)

4. hydrolazy dipeptydów (dipeptydazy)

Karboksypeptydazy i aminopeptydazy rozszczepiają białka do aminokwa­sów przez uwalnianie kolejno końcowych aminokwasów w łańcuchu polipep­tydowym. Wykazują one specyficzność działania w stosunku do wolnych grup karboksylowych i aminowych końcowych aminokwasów. Produktem działa­nia dipeptydaz są aminokwasy uwalniane z dipeptydów naturalnych lub z dipeptydów powstałych w wyniku jednoczesnego działania karboksypep­tydazy i aminopeptydazy na łańcuch polipeptydowy. Proteazy mogą wykazywać selektywność w stosunku do rodników reszt aminokwasowych tworzących rozkładane wiązania peptydowe. Preparaty enzymów proteolitycznych są z reguły mieszaninami enzymów o różnej specyficzności i dzięki temu rozkład białka w wyniku ich działania bywa doprowadzony do końca, tzn. do aminokwasów. Jednak nie wszystkie białka są w podobnym stopniu rozkładane przez enzymy proteolityczne. W proteolizie odgrywa rolę przede wszystkim ilość i układ innych wiązań niż peptydowe, które mogą utrudniać dostęp enzymów do wiązań peptydowych.

Substratami dla proteaz są często białka uprzednio zdenaturowane, o częściowo porozrywanych wiązaniach niepeptydowych (głównie dwusiarczkowych i wodorowych). Optymalne warunki do działania proteaz roślinnych są bardzo zróżnico­wane. Zakres optymalnego pH waha się w granicach 4-6, a optymalnej temp. ok. 40°C lub wyżej, np. u termostabilnej papainy. Wzmożenie aktyw­ności niektórych enzymów proteolitycznych pochodzenia roślinnego można wywołać przez dodanie cysteiny lub glutationu, które odbudowują grupy -SH w centrum aktywnym enzymu. Oznaczanie aktywności proteaz polega na pomiarze produktów proteolizy, tj. wolnych aminokwasów i peptydów, przy jednoczesnym oddzieleniu rozłożonego białka.

Określenie aktywności substancji antyodżywczych

typu inhibitorów trypsyny

W wielu tkankach roślinnych i zwierzęcych stwierdzono obecność inhibi­torów enzymów proteolitycznych. Szczególnie bogate w te związki są rośliny motylkowe. Inhibitory proteinaz regulując metabolizm białek i peptydów pełnią ważne funkcje fizjologiczne. Stanowią też istotny czynnik ochrony roślin przed owadami roślinożernymi i mikroorganizmami hamując aktyw­ność enzymów trawiennych tych organizmów.Z punktu widzenia żywieniowego obecność tych związków jest jednak niepożądana. Obniżają one bowiem przyswajalność białek, a w skrajnych przypadkach wywołują hipertrofię trzustki. Inhibitory te należą do tzw. grupy inhibitorów mieszanych, tzn. hamują enzymy jednocześnie kompetycyjnie i niekompetycyjnie. Utrudniają bowiem powstanie kompleksu enzym-substrat, a także zmniejszają szybkość tworzenia się i uwalniania pro­duktu z tego kompleksu. Dzieje się tak, ponieważ kompleks enzymu z in­hibitorem wiążącym się poza centrum aktywnym ma niższe powinowactwo do substratu niż wolny enzym, a inhibitor wiążący się z centrum aktywnym może reagować także z innym miejscem cząsteczki enzymu i oddziaływać przez to na fazę kataliczną reakcji. W obu przypadkach odgrywają istotną rolę zmiany konformacyjne cząsteczki enzymu i wytworzenie przeszkody sferycznej przez inhibitor, co w efekcie wpływa na mieszany charakter in­hibicji.

1. IZOLACJA INHIBITORÓW TRYPSYNY (białka o masie 11-12 tysięcy)

Wykonanie

1. 30 suchych ziaren fasolki ucierać 15 min w moździerzu, dodając 20 cm³ 0,1M buforu octanowego pH 4,4. Po tym czasie homogenat rozlać do probówek wirówkowych i wirować 20 min przy 6000 g w temperaturze 4°C. Supernatant stanowi su­rowy ekstrakt inhibitorów .

2. Podobnie wyizolować inhibitory ze skiełkowanego ziarna.

• odczynniki

ziarna fasolki

bufor octanowy 0,2M pH 4,4

roztwór trypsyny ( w buforze fosforanowym 0,1M o pH 7,4 z dodatkiem 0,01MCaCl₂.

2-procentowy roztwór kazeiny w buforze fosforanowym 0,1M, pH 7,4, ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 15 min, po schłodzeniu wirować 10 min przy 9000 g i uzupełnić buforem do objętości 50 cm³.

odczynnik strącający białko: odczynnik sulfosalicylowy, 10% TCA

2. OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ANTYTRYPSYNOWEJ

Wykonanie

Próba badana.

W dużej probówce zmieszać 5 ml ekstraktu z 5 ml roztworu trypsyny i pozostawić na 10 min.

Dodać 5 ml 2% kazeiny i inkubować w temperaturze 40°C. Co 5 minut pobierać po 1 ml mieszaniny do oznaczonych probówek z 2 ml odczynnika sulfosalicylowego lub TCA

Przygotować próbę kontrolną czyli zmierzyć aktywność samej trypsyny.

5 ml trypsyny + 5 ml H₂O ( zamiast ekstraktu inhibitora), dodać 5 ml 2% roztworu kazeiny i inkubować w temperaturze 40°C. Co 5 minut pobierać po 1 ml mieszaniny do oznaczonych probówek z 2 ml odczynnika sulfosalicylowego lub TCA

W próbie zerowej do 0,5 ml ekstraktu inhibitora dodać 0,5 ml roztworu trypsyny dodać najpierw 2 cm³ odczynnika strącającego białko, a po 10 min inkubacji w 40°C dodać 0,5 ml 2% roztworu kazeiny.

Inkubacja 40°C	1 z aktywną trypsyną i inhibitorem	Osad /absorbancja	2 z aktywną trypsyną i wodą	Osad /absorbancja	3 zerowa
5 min	15		25
10 mln	110		210
15 min	115		215
20 min	120		220

2. Badanie właściwości fizykochemicznych żywności na przykładzie miodów pszczelich

Miód wytwarzany jest przez pszczoły miododajne z nektaru kwiatowego lub spadzi, a następnie wzbogacany składnikami pochodzącymi z organizmu pszczół. Magazynowanie miodu odbywa się w komórkach plastrów, gdzie następuje zara­zem jego zagęszczanie i dojrzewanie.

Nektar jest to zagęszczony sok roślinny wydzielany przez specjalne narządy roślin zwane nektarnikami.

Spadź jest sokiem roślinnym przetworzonym przez mszyce, czerwce i miodówki. Owady te nakłuwają liście i wysysają sok, z którego wchłaniają białko, sta­nowiące ich pokarm, a pozostałość wydalają w postaci kropelek zwanych spadzią. Miejscem bytowania wymienionych owadów są zarówno drzewa iglaste (sosny, świerki, jodły i modrzewie), jak i liściaste (lipy, klony, brzozy i wierzby).

Rozróżniamy trzy zasadnicze typy miodów: nektarowe, spadziowe oraz nektarowo-spadziowe.

W Polsce produkuje się następujące odmiany miodów nektarowych: rzepako­wy, lipowy, wrzosowy, gryczany, akacjowy i koniczynowy. Miody wielokwiatowe pochodzą z nektaru zbieranego przez pszczoły z różnych roślin łąkowych, leśnych

i górskich. Miody spadziowe natomiast pochodzą głównie ze spadzi jodłowej i świerkowej.

W celu wyprodukowania 1 kg miodu pszczoły muszą zebrać nektar z około 1,3 miliona kwiatów rzepaku albo z 800 tysięcy kwiatów akacji, lub z 8 milionów kwiatów gryki, czy wreszcie z 6,5 miliona kwiatów wrzosu. Po przyniesieniu do ula rzadkiego nektaru czy spadzi zaczynają zachodzić w nich zmiany fizyczne i chemiczne, kończące się stadium, które nazywamy dojrzałością miodu. Nastę­puje to wtedy, gdy nektar zostanie zagęszczony do określonego stopnia, cukry złożone (wielocukry) zostaną przekształcone na cukry proste i wreszcie miód zostanie wzbogacony w enzymy, kwasy organiczne, niektóre aminokwasy. Po zagęszczeniu miodu pszczoły przenoszą go do komórek górnej części plastra, a w miarę przybywania - do coraz niższych. Komórki z miodem całkowicie dojrzałym pszczoły zabudowują cienką powłoką woskową, tzw. zasklepem, chroniąc go w ten sposób przed wpływem niesprzyjających zmian w atmosferze ula. Najwyższy stopień dojrzałości mają zawsze miody z plastrów całkowicie zabudowanych zasklepem woskowym. Jest to prosty sposób rozpoznawania doj­rzałości miodów pszczelich. Dojrzałość odwirowanego miodu można łatwo sprawdzić na podstawie jego gęstości. Najprostszą próbą jest przelewanie miodu łyżką. Miód dojrzały jest na tyle gęsty, że przelewany - układa się warstwami, tworząc wyraźny wzgórek. Z kolei miód niedojrzały jest rzadki, a przy przelewaniu tworzy się wgłębienie. Przy wykonywaniu tej próby należy zwrócić uwagę, aby miód miał tempera­turę pokojową. Każdy miód pszczeli, mający początkowo formę patoki, to jest postać jednolitej przejrzystej cieczy, po pewnym czasie zaczyna krystalizować. W zależności od gatunku miodu, stopnia zagęszczenia i dojrzałości, warunków przechowywania, temperatury jedne miody krystalizują wcześniej, inne później. Im jakość miodu jest lepsza (głównie im mniej zawiera wody, a więcej cukrów), tym prędzej miód krystalizuje. Szybka krystalizacja miodów pszczelich daje równocześnie w pewnym stopniu świadectwo o ich wysokiej jakości. Z tych po­wodów spotyka się w obrocie handlowym miód w dwóch postaciach: jako patokę, czyli miód będący jeszcze w stanie ciekłym, oraz jako krupiec, to jest miód już zestalony wskutek krystalizacji. Krystalizacja, czyli skrupianie się miodu, jest pro­cesem naturalnym, zachodzącym prawie we wszystkich miodach odwirowanych (krajowe krystalizują wszystkie). Jedne rodzaje miodu krystalizują szybciej, inne zaś wolniej, ale na ogół biorąc, miód płynny, który jest nieskrystalizowany jeszcze w styczniu czy lu­tym może być złej jakości. Miód skrystalizowany można łatwo doprowadzić do stanu płynnego ogrzewając go, ale trzeba to wykonywać bardzo ostrożnie, aby miodu nie przegrzać powyżej 45°C, gdyż wtedy traci prawie wszystkie wartości lecznicze i odżywcze. Miód zawsze zawiera ziarna pyłku kwiatowego. Wielkość i kształt pyłków są cechami charakterystycznymi dla poszczególnych gatunków roślin. Liczba ziaren pyłku występujących w miodach jednogatunkowych ji raczej stała w pewnych granicach i stanowi podstawowe kryterium klasyfikacji jakości miodów. Za miód odmianowy uznaje się taki, w którego obrazie pyłkowym ziarna określonego gatunku przekraczają 45% liczby wszystkich ziaren w obrazie mikroskopowym. Najczęściej jest to mieszanina wielu gatunków roślin, ale po 2 stosowaniu odpowiednich wskaźników można obliczyć, w jakiej proporcji nektar poszczególnych gatunków złożył się na miód tak zwany wielokwiatowy. Miody odmianowe są możliwe do pozyskania dzięki pszczelej „wierności" kwiatom określonego gatunku w ciągu dłuższego czasu.

Produkcja miodu sztucznego

Miód sztuczny (namiastka miodu naturalnego) jest to wyrób, którego produkcja opiera się na procesie kwasowej hydrolizy sacharozy, otrzymany zaś produkt aromatyzuje się esencją miodową.

Disacharyd (dwucukier) sacharoza w kwaśnym środowisku pod wpływem podwyższonej temperatury hydrolizuje. Produktem reakcji jest syrop inwertowany, który po zneutralizowaniu sodą zabarwia się karmelem, doprawia olejkami eterycznymi i poddaje krystalizacji.W zależności od składu i konsystencji rozróżnia się następujące rodzaje miodów sztucznych: - miód płynny, otrzymany w wyniku niepełnej hydrolizy cukru (przeważnie z dodatkiem syropu skrobiowego jako antykrystalizatora), - miód stały, o strukturze drobnokrystalicznej, zawierający w porównaniu z miodem płynnym mniej sacharozy. Ziołomiody są to produkty wytworzone przez pszczoły z syropów lub nalewek owoców, kwiatów lub zielonych części roślin, które są podawane pszczołom w tzw. okresach bezpożytkowych. Podany pszczołom surowiec jest przez nie przetwarzany. Produktów tych nie zalicza się do mio­dów naturalnych. Najczęściej spotykanymi ziołomiodami są ziołomiody sosnowe, miętowe, malinowe, głogowe.

Skład miodu sztucznego

		Składniki [%]
Rodzaj miodu		cukier inwertowany (min.)	sacharoza (maks.)	dekstryny (maks.)	woda (maks.)
Sztuczny	płynny	47	30	brak	21
	stały	74	5	brak	21

Skład chemiczny miodu

Najliczniejszą grupę związków występujących w miodzie stanowią węglowo­dany (tabela 2). W największej ilości występują cukry proste: glukoza i fruktoza. Istotnym czynnikiem wpływającym na smak miodu są kwasy organiczne. W naj­większej ilości występują kwasy: glukonowy, jabłkowy i cytrynowy. Zasadniczą grupą związków decydującą o smaku i aromacie miodu są olejki eteryczne pocho­dzące z nektaru. Łącznie wyodrębniono z miodu ponad 50 substancji aromatycz­nych, wśród których znajdują się wyższe alkohole alifatyczne, aldehydy i ketony, a także estry i związki polifenolowe.

Barwa miodu uzależniona jest od obecności różnych barwników. Największe znaczenie mają karotenoidy, głównie P-karoten i ksantofil. Zawartość związków azotowych w miodzie jest niewielka. Spośród białek występujących w miodzie ważną rolę biologiczną spełniają enzymy. Pochodzą one głównie z gruczołów ślinowych pszczół. Do najważniej­szych należy zaliczyć: inwertazę, która powoduje rozpad sacharozy do glukozy i fruktozy; a- i p-amylazę — prowadzące przemiany polisacharydów do dekstryn, a następnie do cukrów prostych; oksydazę glukozy powodującą utlenianie glukozy do kwasu glukonowego. W reakcji tej powstaje nadtlenek wodoru (H₂O₂) - zwią­zek o właściwościach przeciwdrobnoustroj owych. Ponadto miód zawiera pewne ilości mikroelementów (potas, chlor, fosfor, magnez, wapń, żelazo, mangan, ko­balt i inne). W miodzie stwierdzono również występowanie substancji o charak­terze hormonalnym. Ważne zadanie spełnia acetylocholina. Miód zawiera także niewielką ilość witamin. Stwierdzono w nim głównie witaminy z grupy B (B_1; B₂, B₆, B₁₂, kwas foliowy, kwas pantotenowy, biotyna).

Aktywność biologiczna, wartości odżywcze i lecznicze miodu

Dominujący udział cukrów prostych - glukozy i fruktozy - decyduje o wła­ściwościach wzmacniających miodu. Cukry te są wchłaniane w układzie pokar­mowym bezpośrednio do krwi, gdzie w zależności od potrzeb przetwarzane są w energię lub odkładane w wątrobie w postaci glikogenu. Cukry proste biorą też udział w procesie detoksykacji, chroniąc w pewnym stopniu organizm przed dzia­łaniem zanieczyszczonego środowiska oraz obniżając toksyczne działanie alkoho­lu, nikotyny i innych używek. Obecna w miodzie acetylocholina obniża ciśnienie i poprawia krążenie krwi, natomiast cholina działa ochronnie na wątrobę oraz zwiększa wydzielanie żółci. Jony metali zawarte w miodzie (manganu, kobaltu,

żelaza) stymulują produkcję czerwonych ciałek krwi i hemoglobiny. Antybakteryjne właściwości miodu są wynikiem kompleksowego działania kilku czynników Jednym z nich jest powstający H₂O₂, będący efektem aktywności oksydazy glukozowej i katalazy. Bakteriostatyczne działanie miodu wywołane jest także jego wysokim ciśnieniem osmotycznym, jak również może być to efekt działania olejków eterycznych i flawonoidów, występujących w miodzie w niewielkich ilościach. Miód odznacza się również właściwościami przeciwzapalnymi, odnawiającymi i oczyszczającymi.

Skład miodu

Grupy związków	Udział [%]
	średnio	od -do
Cukry proste (fruktoza -39%, glukoza -34%)	70	65-80
Dwucukry redukujące (maltoza, izomaltoza, gencjobioza, furanoza i inne)	3	0-15
Dwucukry nieredukujące (sacharoza, trehaloza)	2	0-10
Trójcukry redukujące (panoza, maltotrioza i inne)	0,5	0-3
Trójcukry nieredukujące (melecytoza, rafinoza)	1,5	0-10
Dekstryny	5	1-10
Związki azotowe (białko ogółem)	0,2	0,05-1
Kwasy (glukonowy, cytrynowy, mlekowy, jabłkowy, bursztynowy, masłowy, propionowy i inne)	0,07	0,01-0,3
Popiół - związki mineralne (mangan, kobalt, żelazo i inne)	0,5	0,07-0,9
Olejki eteryczne (w świeżym miodzie)	0,1	0,03-0,2
Barwniki (karotenoidy, antocyjany, flawony)	10 ^- 5	1,5x10^- 5-1,8x10^- 5
Witaminy i inne substancje	0,04	0-0,1
Woda	17-18	13-23

1. Wykrywanie enzymów amylolitycznych w miodzie

Pod wpływem enzymów zawartych w miodzie następuje między innymi roz­kład dodanej skrobi, której obecność lub nieobecność stwierdza się za pomocą płynu Lugola.

• Odczynniki: skrobia 1% , płyn Lugola

Wykonanie

5 cm³ świeżo przygotowanego 20% roztworu wodnego miodu zalać w pro­bówce 1 cm³ 1 % roztworu skrobi, ogrzewać w ciągu 1 godziny w temperatu­rze 40°C na łaźni wodnej, a następnie dodać kilka kropel płynu Lugola. Jeżeli płyn w probówce zabarwił się na niebiesko, to miód nie zawiera enzymów amylolitycznych. W obecności enzymów płyn w probówce nie zabarwia się. Jako wynik obserwacji należy przyjąć tylko zabarwienie powstające natych­miast po dodaniu płynu Lugola.

4

---