Cytologia kliniczna - ćw. I 25.03.2011

Temat: Przygotowanie materiału cytologicznego do badań.

1. Badanie cytologiczne polega na:

• identyfikacji oraz ocenie wyglądu komórek pobranych drogą złuszczenia, aspiracji lub wirowania ze zmian zmienionych chorobowo

• jest zwykle podstawą wstępnej selekcji przypadków podejrzanych o nowotwór

• nie może zastąpić badania histopatologicznego, które ma decydujące znaczenie dla rozpoznania i wyboru sposobu leczenia

2. Skuteczność badania cytologicznego opiera się o jakość obróbki laboratoryjnej płynu

Standardowe metody muszą gwarantować:

• idealne procedury przedlabolatoryjne

• idealne procedury laboratoryjne:

• wirowanie

• wykonanie rozmazu

• utrwalenie materiału

• barwienie preparatu

Procedury muszą redukować do minimum możliwość powstania artefaktów.

3. Cytodiagnostyka jest pomocna w diagnostyce zmian

• palpacyjnych: sutek, węzły chłonne, skóra, tkanki miękkie, stercze

• głębokich: pod kontrolą RTG, USG, CT, sutek, płuca, wątroba, trzustka, przestrzeń zaotrzewnowa, nerki, nadnercza

• mnogich: pod kontrolą RTG, USG, CT, tarczyca

W przypadku zmian palpacyjnych, wykonując biopsję aspiracyjną cienkoigłową (BAC), w przypadku zmian niepalpacyjnych, wykonując biopsję aspiracyjną cienkoigłową celowaną.

4. Podział metod cytologicznych

Badania cytologiczne: pośrednie i bezpośrednie

POŚREDNIE

• stosuje się w przypadku gdy nie można pobrać wycinka, natomiast dostępne są wydzielina lub wysięk, w którym można spodziewać się złuszczonych komórek nowotworowych lub dysplastycznych

Przykłady:

1. analiza plwociny u chorego z objawami nasuwającymi podejrzenie raka oskrzela

2. badania cytologiczne osadu płynów wysiękowych z jamy opłucnej lub jamy brzusznej, gdy podejrzewa się istnienie nowotworów w tych okolicach

BEZPOŚREDNIE

• polega na mikroskopowej ocenie komórek w rozmazie pobranym wprost z powierzchni zmienionej tkanki

Przykład:

1. ten sposób badania stosuje się przede wszystkim w ginekologii w celu wczesnego wykrywania stanów przedrukowych i raka szyjki macicy

5. Podział metod cytodiagnostycznych

1. Cytologia złuszczeniowa

• ginekologiczna

• szyjka macicy

• jama macicy

• płynów z jam ciała

• otrzewna, opłucna

• PMR

• odcisk, zeskrobiny

• wymazy z jam ciała

1. Cytologia aspiracyjna

• cienkowigłowa cytologiczna!

• 
  gruboigłowa

• trepanobiopsja

Wykonywana:

• ze zmian wyczuwalnych palpacyjnie

• ze zmian położonych głęboko

6. Schemat przygotowania materiału cytologicznego do badań

1. Cytologia ginekologiczna

• rozmaz pobierać specjalną szpatułką, dopasowaną kształtem do tarczy, szczoteczką cytologiczną, np. typu cervex - brush

• umożliwia pobranie w rozmazie jednocześnie komórek z tarczy szyjki macicy, kanału endocervikalnego oraz strefy transformacji.

Metodyka:

1. na odtłuszczonym szkiełku podstawowym wykonać rozmaz szczoteczką

2. utrwalić bezpośrednio po wykonaniu rozmazu - w momencie gdy rozmaz jest jeszcze mokry

3. po utrwaleniu preparaty należy wysuszyć

4. barwienie (PapaNicolau - dokładnie różnicuje materiał bo ma 3 barwniki)

1. Cytologia na podłożu płynnym liquid - based cytology

• wymaz pobrany z szyjki macicy przechowywany jest w płynie, który umożliwia zachowanie kształtu komórek i w takim stanie przekazywany do laboratorium - bez uprzedniego przeniesienia materiału na szkiełko mikroskopowe

• proces ten minimalizuje ryzyko uszkodzenia próbki podczas transportu

• dzięki tej metodzie zostają usunięte z próbki kom. bakterii, drożdży, kom., pojawiające się w stanach zapalnych (ropnych), cząstki śluzu

• komórki z szyjki macicy są równomiernie rozprowadzone, w tym przypadku nie na szkło, lecz w roztworze specjalnego środka konserwującego

• jest to metoda dokładniejsza i czulsza niż klasyczna metoda rozmazu szczoteczkowego

7. Porównanie metod opartych na podłożu płynnym

metoda charakterystyka	Thin Prep	Sure Path
płyn konserwujący	słaby alkohol metylowy	słaby alkohol etylowy
metoda przygotowania monowarstwy komórek	1. materiał umieszczony na filtrze 2. filtr odciśnięty na szkiełko podstawowe	1. sedymentacja 2. odwirowanie próbki
obszar monowarstwy komórek	20 mm	13 mm
liczba komórek na szkiełku	ok. 53	ok. 73 000
szczoteczka ginekol. pozostawiona w płynie	NIE	TAK

8. Cytologia na podłożu płynnym cd.

1. SurePath Pap (Beton Dockinson, Franklin Lakes)

• metoda, w której wymagane jest aby główka szczoteczki została umieszczona w płynie konserwującym (zawierającym alkohol etylowy) a następnie przesłana do laboratorium

• metoda oparta na zasadzie sedymentacji, której efektem jest utworzenie pojedynczej warstwy komórek opłaszczonych na szkiełku podstawowym

• utrwalenie - słaby alkohol etylowy ( < 95% )

• możliwe przygotowanie nie tylko materiału ginekologicznego, ale także cytologii nieginekologicznej

• podczas procesu wirowania z materiału zostaje usunięte ok. 75% krwinek oraz śluzu (poprawienie jakości preparatu)

• metoda dokładniejsza od ThinPrep Pap

2. Cytyc. ThinPrep Pap Test (Cytyc. Corp. Marlborough)

• metoda, w której nie jest wymagana obecność główki szczoteczki ginekologicznej w płynie konserwującym

• metoda oparta na utworzeniu na szkiełku podstawowym pojedynczej warstwy komórek na zasadzie filtracji

• utrwalacz - alkohol metylowy

Warunek !!! należy użyć dodatkowych metod usuwających krwinki czerwone i śluz

9. Cytologia ginekologiczna cd.

Ocena preparatów w mikroskopie kontrastowo - fazowym

• najlepiej nadają się świeże rozmazy, wykonane natychmiast po pobraniu z narządów i tkanek

• optymalne jest jednowarstwowe ułożenie komórek na szkiełku podstawowym

• natychmiast po pobraniu i rozprowadzeniu materiału na szkiełku nakrapla się na preparat 1 - 2 krople soli fizjologicznej

• tak wykonany rozmaz należy natychmiast przykryć szkiełkiem nakrywkowym

• wideokolaskopowa wizualizacja tarczy szyjki macicy ułatwia prawidłowe pobranie materiału cytologicznego

• kilkukrotne obrócenie szczoteczki cytologicznej zapewnia pobranie wystarczającej ilości komórek do badań cytologicznych

UWAGA:

• ocenę w mikroskopie kontrastowo - fazowym utrudniają zanieczyszczenia, które rozpraszają światło i ujemnie wpływają na jakość oraz kontrastowość oglądanych obrazków

• pracę utrudniają pęcherzyki powietrza, krople tłuszczu, krystalizujący śluz szyjowy i NaCl, zawarty w szybko wysychającej soli fizjologicznej

• podczas wysychania komórki obkurczają się

• interpretację wymazów mogą również zaburzać zanieczyszczenia krwią

• aby mieć długotrwałą możliwość weryfikacji preparatów należy je wybarwić

10. Cytologia nieginekologiczna

1. Płyny z jam ciała (pleural, peritoneal, pericardian)

• materiał dostarczyć świeży/bez utrwalania

• niektóre laboratoria wymagają dodania heparyny, jednak nie jest to wymagane

• rutynowo przygotować materiał do badań - odwirowanie w cytowirówce

• obroty dobrane do odpowiedniego rodzaju płynu biologicznego

• do badania cytodiagnostycznego należy przesłać niewielką ilość płynu - ok. 10ml lub jego wielokrotność

• płyn powinien być przesłany do badania od razu po pobraniu, w czystym (jałowym) pojemniku

• następnie materiał odwirować 2 - 3 razy

• wirowanie pozwala na uzyskanie stosunkowo dużej ilości osadu do badania cytologicznego

Gdy nie ma możliwości przesłania płynów bezpośrednio do laboratorium:

• można przechowywać płyn przez kilka, kilkanaście godzin w lodówce, a następnego dnia przekazać do badania

• oddać płyn do laboratorium analitycznego w celu odwirowania i zalania osadu płynem utrwalającym ( po dodaniu płynu należy osad wymieszać z płynem bagietką szklaną)

Ocena mikroskopowa płynów:

1. ilość płynu

2. gęstość płynu

3. kolor

4. przejrzystość

Płyny:

1. wodniste/gęste

2. przejrzyste/opalizujące/mętne

3. zawierające drobiny tkanek/komórek (nowotworowych, włóknika)

1. Biopsje cienkoigłowe

• materiał pochodzący z biopsji tarczycy, węzłów chłonnych, piersi oraz sutka

• przygotowanie prze lekarza klinicystę rozmazów na szkiełku podtsawowym

• metoda rozmazu - nickel method, pull - apart

• utrwalenie materiału utrwalacze aerozolowe (natychmiast po pobraniu - nie dopuszczając do wyschnięcia materiału

1. Płyn mózgowo rdzeniowy

• dostarczyć natychmiast do laboratorium

• jeśli nie ma możliwości dostarczenia natychmiastowego - użyć pre-utrwalaczy (słaby roztwór alkoholu etylowego, płyn Saccomanna)

• odwirować materiał

• gotowe cytospiny utrwalić

• materiał gotowy do barwienia ( barwienie PapaNicolau)

1. Bezpośrednie wyskrobiny z ran

• lekarz klinicysta przygotowuje rozmaz na szkiełku podstawowym

• metoda rozmazu - nickel method

• utrwalenie materiału

1. Popłuczyny pęcherzowo - oskrzelowe, popłuczyny z żołądka, przetok

• NIE należy dodawać płynów utrwalających do materiału

• materiał odwirować

• gotowy cytospin utrwalić

• płyny utrwalające - aerozolowe

1. Wymazy szczoteczkowe z drzewa oskrzelowego, przełyku, żołądka

• wykonać bezpośrednie rozmazy na szkiełku podstawowym

• metoda rozmazu - nickel method

• natychmiast utrwalić

• utrwalenie - utrwalacze aerozolowe

• ewentualnie materiał może zostać poddany obróbce płynnej - umieszczenie szczoteczki w płynie konserwującym

• metoda ThinPrep oraz SurePath

1. Mocz

• NIE należy poddawać badaniu cytologicznemu pierwszej porannej porcji moczu

• materiał odwirować

• gotowy cytospin utrwalić

• utrwalacz - aerozolowy

• ze względu na niską adhezyjność materiału biologicznego - używać szkiełka o zwiększonej adhezyjności

• jeżeli nie ma możliwości wykonania badania bezpośrednio po oddaniu moczu, płyn odwirować, zalać pre-utrwalaczem, odstawić do lodówki

11. Utrwalanie materiału cytologicznego

• Płyny utrwalające:

• 95% alkohol etylowy

• 95% alkohol metylowy

• utrwalacze aerozolowe (alkohol etylowy, aceton, glikol polietylenowy)

• Roztwory utrwalaczy - substytuty alkoholu 95%

• 80% alkohol izopropylowy

• 100% alkohol metylowy

Temat: Techniki diagnostyki cytologicznej - szczegółowa charakterystyka.

1. Rozmazy cytologiczne

• Przydatność rozmazu do oceny

• jakość wykonania rozmazu

• sposób utrwalenia materiału

• reprezentacja próbki

• Ocena mikroskopowa rozmazu

• liczebność komórek w rozmazie

• układy przestrzenne komórek

• rozproszone, pojedynczo leżące

• płaty, grupy, gniazda

• Cechy cytologiczne

• wielkość komórek, stosunek jądro/cytoplazma (N/C)

• struktura jądra i cytoplazmy

• Tło rozmazu

• martwica

• komórki wysięku zapalnego

2. Technika rozmazów

• Technika „WET FILM” ( technika kropli )

• zalecana jako metoda prosta i szybka

• może zastąpić w wielu przypadkach wykonanie badania śródoperacyjnego

• pozwala na odpowiedź w ciągu 10 -15 min po otrzymaniu materiału

Metodyka:

1. za pomocą ezy/mikropipety nanieść kroplę z górnej warstwy osadu na środek szkiełka podstawowego

2. obok kropli nanieść kroplę roztworu błękitu toluidyny

3. wymieszać obie krople za pomocą rogu szkiełka nakrywkowego

4. przykryć rozmieszczoną kroplę szkiełkiem nakrywkowym

Preparat ten jest gotowy do oceny mikroskopowej, przechowywany w lodówce do czasu zakończenia badania, następnie eliminowany.

• Cytologia płynów ( oprócz PMR i moczu)

• po odwirowaniu materiału pobrać 1 - 2 krople z górnej części osadu za pomocą ezy mikrobiologicznej

1. gdy materiał został pobrany ezą mikrobiologiczną - wykonać rozmaz według standardowej procedury crosshatch metod

2. gdy materiał pobrany jest za pomocą mikropipety

• rozmaz wykonać rozcierając kroplę materiału używając drugiego szkiełka podstawowego - metoda pull - apart

• technika prosta

• otrzymanie monowarstwy komórek opłaszczonych na szkiełku

• Metoda crush (mash)

• po odwirowaniu materiału z górnej części palety pobieramy trochę komórek i ruchem kolistym rozcieramy

• umożliwia utworzenie materiału - rozgniatając rozmaz zawierający fragmenty tkanek, śluz

• Metoda nickel

• cytologia złuszczeniowa

cytologia ginekologiczna, wyskrobiny z ran (komórki złuszczone)

• szpatułką (szczoteczką) robimy ślimaka na szkiełku ( 2 rozmazy na 1 szkiełku)

3. Technika przygotowania preparatów - cytospin

• PMR

• mocz

4. Metoda cell - block

• technika cell - block jest jednym z najdawniej stosowanych sposobów przygotowania osadów z płynu

• zwykle zawierają niewielką ilość materiału komórkowego/tkankowego

• jest to procedura bloczka parafinowego

* utrwalacz - 10% formalina buforowana lub płyn Dibosque kw. pikrynowy

Metodyka:

1. po wykonaniu rozmazów, część aspiratu cienkoigłowego pozostałego w strzykawce/igle utrwalić (10% formalina buforowana)

2. utrwalony aspirat odwirować

3. po odwirowaniu scalić osad żelem - uzyskujemy żelowy cell - block

4. następnie mikrokasetkę z żelowym CB przenieść do rutynowej kasetki histopatologicznej

5. utrwalenie materiału w formalinie

6. realizacja procedury bloczka parafinowego - procesor tkankowy

Zalety:

• lepszy wgląd w cytoarchitekturę

• możliwość porównania efektów barwień dodatkowych na kolejnych skrawkach

• efekt barwień immunocytochemicznych jak w rutynowych preparatach histologicznych

• materiał tkankowy przydatny do metod molekularnych: FISH

Wady:

• gorzej zachowane szczegóły cytologiczne w porównaniu z preparatami cytologicznymi z rozmazów bezpośrednich

• wydłużenie procedury diagnostycznej

• podrożenie kosztów laboratoryjnych

5. Cytopreparation decision tree [!]

histologiczne

TAK

czy jest śluz?

NIE

Crush method

utrwalenie aerozolem

bogato komórkowy

ubogo komórkowy

(np. PMR)

słaba adhezyjność

wirowanie

wkładamy do cytowirówki i tworzymy cytospiny

dobra adhezyjność

utrwalenie aerozolem

Pull apart

albo

crossbath

utrwalenie:

aerozol lub alkohol 95%

płyn bogatokomórkowy

płyn bezśluzowy

---