Komórki macierzyste

1. zdolność do samoodnawiania - zdolność do odnawiania własnej populacji

2. zdolność do różnicowania w komórki różnych tkanek

Podział ze względu na zdolność do różnicowania:

1. totipotencjalne - zygota. Mogą różnicować się w struktury budujące organizm oraz struktury pozazarodkowe.

2. pluripotencjalne - blastocysta (węzeł zarodkowy). Nie mogą się różnicować w struktury pozazarodkowe.

3. multipotencjalne - listki zarodkowe. Różnicują się w komórki, które pochodzą z tego listka

4. unipotencjalne - róznicują się w jeden typ komórek.

Podział ze względu na pochodzenie:

• 1. Macierzyste komórki zarodkowe - ES

• pluripotencjalne

• wymagają do wzrostu fibroblastów zarodkowych. Pod wpływem mitomincyny C (?) albo promieniowania gamma zablokowaniu ulegają ich podziały. Dzięki temu komórki macierzyste mogą rosnąć (?). Wymagają też czynnika przeciwbiałaczkowego lif. Łączy się on z receptorem na powierzchni komórki i uruchamia ścieżkę zależną od kinazy JAK, która prowadzi do aktywacji czynnika transkrypcyjnego Stat3.

• W stanie niezróżnicowanym utrzymują komórkę czynniki: Oct4, Nanog i Stat3.

• Testy na pluripotentność:

• in vivo - test na zdolność tworzenia teratom, czyli łagodnych guzów nowotworowych, mających tkanki z 3 listków zarodkowych. Jeśli są pluripotencjalne i wprowadzimy je do myszy z zaburzonym układem immunologicznym, to komórki takie wytworzą teratomy.

• in vitro - test na tworzenie kul zarodkowych. W odpowiednich warunkach komórki ES tworzą kule zarodkowe, w których są komórki pochodzące z 3 listków zarodkowych.

Praca z 2001 roku pokazała, że z komórek ES można otrzymać kardiomiocyty albo przynajmniej komórki, które je przypominają. W badanych komórkach były białka transkrypcyjne charakterystyczne dla kardiomiocytów i mRNA kodujące czynniki transkrypcyjne charakterystyczne dla nich. Inna praca wykazała, że można otrzymać również oocyty. Po 12 dniach badania zaobserwowano struktury przypominające pęcherzyki jajnikowe i po analizie hormonów okazało się, że jest w nich bardzo dużo hormonów płciowych. Otoczka oocytu była zbudowana z dokładnie tych samych białek, co otoczka prawdziwego oocytu.

Cechy komórek ES:

• monogenność

• krótkie cykle komórkowe, bo krótka faza G1

• aktywność fosfatazy alkalicznej i telomerazy. Fosfataza jest często wykorzystywana jako marker tych komórek.

• specyficzne markery powierzchniowe (SSEA) i jądrowe (Oct4, Nanog, Sox2).

• Zastosowanie:

• badanie procesów zachodzących w rozwoju zarodkowym bez konieczności manipulowania zarodkami

• badanie funkcji określonych genów

• tworzenie zwierzęcych modeli chorób ludzkich

• badanie toksyczności leków

• w przyszłości źródło komórek do transplantacji

• uzyskiwanie ES z węzła zarodkowego blastocysty, żeby obejść problem odrzutu przeszczepu - klonowanie terapeutyczne

• 2. Komórki macierzyste płynu owodniowego - AFS

• izolowane z płynu owodniowego podczas amniopunkcji

• stabilny kariotyp - mimo że szybko się dzielą, nie tracą telomerów

• krótkie cykle komórkowe

• długie telomery upodabniają je do komórek ES

• mogą się różnicować do tkanki tłuszczowej, mięśniowej, kostnej, w komórki wątroby, kardiomiocyty, komórki naczyń krwionośnych

• multipotencjalne

• w warunkach in vitro różnicują się w neurony

• biorą udział w formowaniu kości

• 3. Komórki macierzyste występujące u organizmów dorosłych - ASC

• w tkankach, które charakteryzują się wysoką aktywnością: w szpiku kostnym, mięśniach szkieletowych, wątrobie, ale również w mózgu, rogówce, naskórku, sercu być może, jelicie

• prawdopodobnie wszystkie nowotwory wywodzą się z komórek macierzystych

• Izolacja:

• niewielka liczba komórek w tkankach: najwięcej w szpiku - milion; w sercu tylko 500

• trudne do wyizolowania z powodu miejsca występowania

• trudne w odróżnieniu od komórek progenitorowych, które nie są już zdolne do odnawiania

• ograniczony czas życia - często obumierają podczas hodowli

• ograniczone zdolności do różnicowania, bo w większości są komórkami multipotencjalnymi

2 typy: HSC (komórki krwi) i MSC - mezenchymalne komórki macierzyste (kości, chrząstki, tkanka tłuszczowa)

• HSC:

W wyniku napromieniowania zachodzi mieloablacja, czyli śmierć wszystkich komórek w organizmie. Jeśli napromieniuje się cały organizm z wyjątkiem kości i śledziony, jest on zdolny do przeżycia, co świadczy o tym, że w tych miejscach są komórki zdolne do odtwarzania układu hematopoetycznego. Podanie zawiesiny komórek z kości lub śledziony powoduje rekonstytucję zniszczonego układu hematopoetycznego. W śledzionie (u gryzoni) i w kości udowej (u gryzoni i ludzi) znajdują się komórki odpowiedzialne za utrzymanie układu krwiotwórczego.

Identyfikacja in vivo:

• u gryzoni test kolonii śledzionowych

• u ludzi i innych zwierząt test rekonstrukcji - sprawdza się, czy we krwi biorcy są komórki dawcy

źródła:

• szpik (0,5 - 3%)

• krew pępowinowa (0,1 - 0,5%)

• mobilizowana krew obwodowa (0,05 - 0,2%)

Zastosowanie:

• transplantacja szpiku w chorobach nowotworowych układu hematopoetycznego lub po radio-, chemioterapii.

Plastyczność hematopoetycznych komórek macierzystych - zdolność do różnicowania się w inne typy komórek, niż teoretycznie. Może być wynikiem:

a) fuzji komórki macierzystej z komórką ukierunkowaną tkankowo lub zróżnicowaną lub

b) zmiany w ekspresji genów indukowanych warunkami hodowli in vitro lub

c) heterogenności populacji komórek macierzystych izolowanych z organizmu.

• MSC:

• wyizolowane w 1966 jako komórki progenitorowe

• to samo co MAPC i MPC

• są adherentne i przylegają do szalki

• mają wrzecionowaty kształt i przypominają fibroblasty

• są zdolne do różnicowania w komórki tkanki kostnej, chrzęstnej i tłuszczowej

• nie mają mrkerów charakterystycznych dla HSC, czyli CD45 i CD34

Zastosowanie:

• niska immunogenność (hamują APC) , więc nie wywołują reakcji u biorcy

• hamują namnażanie limfocytów

• próby kliniczne: przyspieszają rekonstytucję układy hematopoetycznego; łagodzą przebieg zaburzeń mezenchymatycznych, czyli np. przyspieszają gojenie ran; tworzą środowisko, które sprzyja łagodzeniu uszkodzeń OUN.

• Komórki satelitowe

Znajdują się między sarkolemmą włókna mięśniowego a błoną podstawną. Odpowiadają za wzrost i regenerację mięśni szkieletowych u dorosłych organizmów. Jeśli mięśnie są nieuszkodzone, komórki te są w stanie spoczynku. Są zdolne do odtwarzania własnej populacji. Ich markerem jest Pax7. W utrzymaniu siły i struktury mięśnia bierze udział dystrofina. Jeśli jej nie ma, mięśnie są bardzo słabe. W nowoutworzonych mięśniach występuje ekspresja dystrofiny.

Kariotyp

kariotyp - zapis zestawu chromosomów

kariogram - opis chromosomów

Pewne specyficzne barwienia chromosomów metafazowych wykazały, że dla każdego organizmu jest charakterystyczny wzór ułożenia części mniej lub bardziej zheterochromatynizowanych. Są to tzw. prążki. W latach 60., 70. podjęto pierwsze próby wprowadzenia międzynarodowej konwencji kariotypu i wprowadzono ją w 1995. Bierze się w niej pod uwagę:

a) ogólną liczbę chromosomów - wypisuje się ją na początku

b) chromosomy płci - po przecinku

c) ewentualne aberracje, które jesteśmy w stanie zidentyfikować - po następnym przecinku.

Budowa chromosomu metafazowego:

odcinek centromerowy - przewężenie pierwotne

Każda chromatyda ma na końcu zestaw powtarzalnych sekwencji (człowiek TTAGGG). Sekwencja ta, zwana sekwencją telomerową jest bardzo konserwatywna. Rodząc się mamy na każdym chromosomie 6-10 tys. nukleotydów telomerowych. Wraz ze starzeniem ubywa ich. Chorzy, którzy szybko się starzeją, mają minimalna ilość tych nukleotydów i bardzo skrócone odcinki telomerowe. Odcinki telomerowe chronią przy podziałach przed przypadkowym wycięciem ostatnich sekwencji. Jeżeli mimo wszystko dojdzie do nadmiernego skrócenia, włączany jest enzym - typ odwrotnej transkryptazy - telomeraza. Jeśli mamy jakiś defekt w genie telomerazy, to również doprowadza to do przedwczesnego starzenia. W klasyfikacji chromosomów bierze się pod uwagę położenie centromeru:

a) chromosom metacentryczny - centromer oddziela ramiona o równej długości

b) chromosom submetacentryczny - jedno ramię jest wyraźnie dłuższe (q), a drugie krótsze (p)

c) chromosom akrocentryczny - nie ma krótkiego ramienia. Do miejsca przycentromerowego jest dołączona cienka nitka (nitka satelitarna), do której jest przyczepiona grudka chromatyny (satelita). Jest nieczynny transkrypcyjnie.

Oznaczanie kariotypu:

Pobiera się próbkę, np. limfocytów krwi obwodowej, rzadziej fibroblastów, komórek innych tkanek, płynów wysiękowych, fragmenty guzów. Do badania prenatalnego płyn owodniowy. Pobrane komórki są rozmnażane (zaszczepiane czynnikami pobudzającymi wzrost). Dodaje się tez czynniki synchronizujące podziały komórki (?). Kiedy komórki dzielą się, dodaje się czynniki, które zatrzymają je na stadium metafazy, czyli kolchicynę i kolchicynopodobne. Następnie wywołuje się szok fipotoniczny (?) co daje rozproszenie chromosomów, utrwala się chromosomy do barwienia, nakrapla na szkiełko podstawowe, barwi i otrzymuje się płytkę metafazalną. Następnie wycina się każdy chromosom i składa pary chromosomów według określonej konwencji, od największego do najmniejszego chromosomu.

Barwienie chromosomów:

Każdy chromosom ma swój charakterystyczny sposób barwliwości, który zależy od stopnia heterochromatynizacji poszczególnych odcinków. Nie jest bez znaczenia, czy barwimy chromosomy we wczesnej metafazie, czy w późnej. We wczesnej są mniej zheterochromatynizowane - mniejsza jest kompakcja odcinków heterochromatyny. W związku z tym na obrazie zawsze musi być podana metoda, żeby móc porównać.

a) prążki G (barwnik Giemsy) - najczęstszy sposób barwienia. Odczynnik ten barwi na ciemno rejony o dużej zawartości par A-T - są to rejony, które stosunkowo późno replikują i zawierają mało aktywnych genów. Najczęściej stosuje się go na chromosomy wczesnometafazowe. Ze względu na stopień kompakcji chromosomów roślinnych (bardzo silna kompakcja od początku metafazy) metoda ta kiepsko nadaje się do kariotypowania roślin.

b) prążki Q (quinacrine) - odpowiednik prążków G. Zheterochromatynizowane rejony są wybarwione fluoresceiną (na ogól pinakryna (?)).

c) prążki R - odwrotność prążków G.

d) prążki C - określanie położenia centromerów. Barwi tylko heterochromatynę przycentromerową.

Powszechnie stosuje się również FISH. Stosowane jest jeśli zależy nam na czasie i mamy sondy na geny, które powodują daną chorobę. Wykorzystywany jest również do komórek interfazalnych.

Heteromorfizm chromosomów pod względem heterochromatynizacji

Około 30% genomu populacji ludzkiej ma niewielkie, ale widoczne różnice w budowie chromosomów, zwłaszcza w umiejscowieniu stref silniejszej heterochromatynizacji i różnice te mogą występować przede wszystkim na chromosomie 1., 9., 16., wszystkich akrocentrycznych oraz na długim ramieniu chromosomu Y. Daje to zmiennośc osobniczą i jednocześnie jest przykładem polimorfizmu genetycznego. Dotyczy to odcinków nieczynnych transkrypcyjnie.

Aberracje chromosomowe:

5. Aberracje dotyczące liczby chromosomów - aberracje liczbowe - Euploidie

a) Poliploidia - aberracje dotyczące całych zestawów chromosomów - zwielokrotnienie kompletu. W przypadku człowieka, ptaków i innych wyższych kręgowców jest to cecha letalna.

• triploidia - zapłodnienie oocytu przez 2 plemniki lub nie dochodzi do wyrzucenia ciałka kierunkowego i oocyt staje się diploidalny

• tetraploidia - brak I podziału zygoty lub zaburzenie podziału w późniejszym okresie (częściowa tetraploidia)

b) Monoploidia

3. Aneuploidie - dotyczą poszczególnych chromosomów

• trisomia - 3 chromosomy zamiast dwóch, np. Down. Oprócz Downa wszystkie są letalne od razu lub bardzo wcześnie po urodzeniu. Szanse przeżycia są z trisomią 13. i 18.

• monosomia - nieletalny tylko zespół Turnera

nondysjunkcja - nierozdzielenie się chromosomów homologicznych lub chromatyd siostrzanych. Mejotyczna: Jeśli dojdzie do niej podczas I podziału mejotycznego, to po tym podziale jedna komórka będzie pozbawiona chromosomu, a druga otrzyma 2 chromosomy. Wobec tego po II podziale będą 2 komórki bez chromosomów i 2 z podwójnym. Jeśli dojdzie do nondysjunkcji podczas II podziału mejotycznego to prawdopodobieństwo powstania gamety z dodatkowym chromosomem jest już dużo mniejsze.

Mitotyczna: Jeśli nastąpi nondysjunkcja podczas mitozy, czyli np. podczas bruzdkowania to nie wszystkie komórki będą nieprawidłowe. Mamy wtedy do czynienia z tzw. mozaikowatością. Przykładem jest zespół Downa - może być słaby lub silny - jesli do nondysjunkcji dojdzie w późniejszych etapach bruzdkowania, będziemy mieć mniejszą liczbę komórek z trisomią. Konsekwencją nondysjunkcji mitotycznej jest też zespół Turnera - jeden z chromosomów płci „ślimaczy się” podczas anafazy.

Częstość:

zespół Downa - 1:600

zespół Edwardsa (trisomia 18.) - 1:10000 (?)

zespół Klinefeltera - 1:700

zespół Turnera - 1:3000

Aberracje strukturalne:

Łamliwość chromosomów. Może nastąpić translokacja między jednym a drugim chromosomem lub translokacja robertsonowska - zwiazana przede wszystkim z chromosomami akrocentrycznymi; wejście oderwanego odcinka między określone geny. Translokacja jest najczestszą aberracją strukturalną. U człowieka translokacja robertsonowska występuje najczęściej pomiędzy 13. i 14. oraz 9. i 27. (?).

Tworzenie się izochromosomów - pęknięcie w rejonie centromerowym. Łączą się wtedy krótkie ramiona.

Przewlekła leukemia szpikowa: Translokacja i inwersja dwóch genów. Leukemi towarzyszy powstanie krótkiego i inaczej barwiącego się jednego z chromosomów 22 - chromosomu Philadelphia. Wytworzeniu tego chromosomu towarzyszy nie tylko translokacja, ale również inwersja określonego genu. Na chromosomie 9. jest gen ABL, a na 22. gen BCR. Translokacja genu ABL na chromosom 22. łączy się z inwersją tego odcinka w gen BCR. Oba te geny są esencjalne i podstawowe dla przebiegu cyklu komórkowego. Ta insercja powoduje fuzję i zmienia całkowicie ekspresję genu BCR. Często kawałek 22. chromosomu akrocentrycznego jest gubiony.

Jeśli mamy sondę na gen ABL i BCR, to możemy bardzo szybko zdiagnozować, czy w pobranym materiale rzeczywiście występuje leukemia tego typu.

Rośliny

Poliploidia - podczas tworzenia bielma. Diploidalne wtórne jądro woreczka zalążkowego + haploidalne (?) = triploidalne (?).

Euploidia - pomniejszenie lub zwielokrotnienie całego garnituru chromosomalnego

Aby móc wytwarzać funkcjonalne gamety, poliploidia musi być parzysta, żeby chromosomy mogły dobierać się w pary.

Naturalne poliploidy:

3. hermafrodyty, np.dżdżownica

4. organizmy romnażające się partenogenetycznie, np.: skorupiaki, salamandra plamista

Poliploidyzacja roślin sztuczna jest wykorzystywana od dawna. Komórka poliploidalna jest większa. Triploidalne winogrona i ogórki są bez pestek. Korzystnie na poliploidyzację wpływają niektóre warunki srodowiska, np. gwałtowne wahania temperatur. Obniżenie temperatury powoduje nondysjunkcję chromosomów i zaburzenie rozchodzenia się chromosomów homologicznych. Na Islandii, gdzie wahania są duże, ok. 70-80% roślin to poliploidy.

Alloploidia - garnitur chromosomalny pochodzi od dwóch różnych gatunków, np. muł ma n=32 od klaczy i n=31 od osła; pszenżyto; brokoflower (brokuła + kalafior).

Apoptoza

Większość tkanek ma całe swoje linie rozwojowe, które w określonym momencie różnicowania się organizmu umierają w sposób całkowicie kontrolowany. Historia badań nad PCD rozpoczęła się w latach 60. Już wtedy było wiadomo, że śmierć jest niezbędna, aby powstawały nowe tkanki. W latach 70. było już wiadomo, że śmierć ta jest zaprogramowana, a nie przypadkowa. Ukoronowaniem badań nad apoptozą była Nagroda Nobla w 2002 roku za zidentyfikowanie genów regulujących apoptozę i rozwój u Caenorhabditis elegans. Większość genów homologicznych do tych u C.elegans występuje też u człowieka. W określonym momencie umierają określone komórki.

Nekroza - jedna z form niekontrolowanej śmierci.

Morfologia apoptozy:

• komórka zaczyna się kurczyć

• tworzenie w błonie pęcherzyków, z których powstają ciałka apoptotyczne - obłonione fragmenty komórek

• zmiana przepuszczalności błony mitochondiów

• fragmentacja jądra, która zwykle poprzedzona jest kondensacją chromatyny

• ciągłość błon komórkowych jest długotrwała

Morfologia nekrozy:

4. komórka pęcznieje

5. dezintegracja wszystkich błon i organelli w obrębie komórki

6. strawienie cytoszkieletu

7. wyciek elektrolitów z komórki

Apoptoza u zwierząt:

Sekwencja zmian biochemicznych i morfologicznych:

6. Głównym wyznacznikiem apoptozy jest degradacja DNA jądrowego w określonych miejscach pomiędzy nukleosomami - internukleosomalna fragmentacja DNA. DNA zostaje pocięte na bardzo równe odcinki.

7. Drugim wyznacznikiem jest kondensacja chromatyny.

8. Częstym wyznacznikiem jest też uwolnienie cytochromu c z mitochondrium wskutek zmian w przepuszczalności błon. Uruchamia to ciąg dalszy mechanizmów związanych z apoptozą.

9. Komórka traci wodę i elektrolity, co powoduje obkurczenie komórki

10. Kondensacja cytoplazmy

11. Rozpad komórki na ciałka apoptotyczne

Przyczyny apoptozy:

• musi istnieć równowaga między proliferacją a obumieraniem komórek; komórki krwi i nabłonkowe muszą się stale odtwarzać

• w określonych etapach rozwoju musi nastąpić śmierć, np. zanikanie ogona kijanki lub tkanki pomiędzy palcami płodu, obumieranie nadmiaru komórek nerwowych podczas tworzenia się synaps

• niszczenie komórek, które zagrażają integralności organizmu, np. zainfekowanych przez wirusy lub komórek zarodkowych z defektywnym DNA. Induktorem apoptozy jest białko p53. Jego kumulacja następuje, gdy dochodzi do utworzenia DNA.

Indukcja:

a) szlak zewnętrzny (receptorowy)

Sygnał zewnętrzny musi napotkać receptor w błonie komórkowej. Jest charakterystyczna dla ssaków; nie występuje u C.elegans. Pewne czynniki np. zapalne cytokiny rozpoznają pewne określone receptory w błonie, tworzy się tzw. kompleks śmierci, dochodzi do uruchomienia określonych enzymów i następuje degradacja białek i DNA.

5. Ligand rozpoznaje odpowiedni receptor (Fas + FasL) i tworzy się kompleks DISC (death-inducing signaling complex). Powoduje to aktywację kaspazy 8 i następnie kaskady kaspaz.

6. TNF + TNRF ½ --> DISC --> kaspaza 8 --> kaskada kaspaz

Kaskada kaspaz powoduje cięcia w obrębie filamin, czyli białek otoczki jądrowej, które uruchamiają endonukleazy, które tną DNA.

b) szlak wewnętrzny (mitochondrialny)

Związany ze zmianą potencjału błonowego mitochondrium, otwieraniem się kanałów mitochondrialnych i wydostaniem się cytochromu c z mitochondrium. Po wydostaniu się cytochromu c tworzą się kompleksy zwane apoptosomami, które zbudowane są z kilku białek: białka cytochromu c, białka Apaf 1 i prokaspazy 9. Po utworzeniu apoptosomu, następuje kaskada kaspaz, która indukuje zmiany w otoczce jądrowej i białkach oraz enzymy, które powodują fragmentację DNA. Błona mitochondrialna jest chroniona przez białka przeciwapoptotyczne (Bcl2 i Apaf1). Wskutek sygnału inne białka powodują, że błona przestaje byc chroniona i dochodzi do wycieku cytochromu c. Monomer Apaf1 ma określone domeny, z których każda dołącza się do innej części apoptosomu:

- CARD - do kaspaz

- NB-ARC - powoduje oligomeryzację Apaf1

- WD40 - do cytochromu c

Kaspazy:

• faza wykonawcza apoptozy

• są proteazami cysteinowymi, które tną białka przy kwasie asparaginowym

• występują w cytoplazmie w formie nieaktywnej w postaci proenzymów i stają się aktywne dopiero po połączeniu z innymi czynnikami

• dzieli się je na kaspazy inicjujące apoptozę i tzw. egzekutory apoptozy. Inicjujące to kaspaza 9 w przypadku szlaku mitochondrialnego i 8 w przypadku receptorowego, a egzekutory to kaspazy 3 i 7.

Apoptoza u roślin:

Nie zawsze jest pod kontrolą tych samych genów, które funkcjonują u zwierząt. Różnice między apoptozą u zwierząt i roślin występują, bo:

• są różne wzory rozwoju organizmów roślinnych i zwierzęcych

• jest inna strukturalna i metaboliczna organizacja komórek roślinnych i zwierzęcych

• fitohormony mają inną budowę i funkcję niż hormony zwierzęce

• u roślin nie ma homologów Bcl-2, Bax i kaspaz

Apoptoza zachodzi zarówno w organach generatywnych, jak i wegetatywnych. Zachodzi podczas starzenia się liści, degeneracji tapetum, czyli warstwy wyściełającej komorę pyłkową, podczas starzenia się czapeczki i różnicowania się naczyń; w mezofilu, tkance bielma.

- Wyznacznikiem apoptozy jest internukleosomalna fragmentacja DNA. Kaspazopodobne białka uruchamiają określone endonukleazy, które tną DNA.

- Drugim wyznacznikiem jest kondensacja chromatyny. Jest to łatwiejsze do stwierdzenia u roślin jednoliściennych.

Metoda obserwacji: elektroforeza pojedynczych komórek - metoda kometkowa

Komórki z pofragmentowanym DNA tworzą obraz komety. Fragmenty tworzą ogon komety. Jest to łatwe do zaobserwowania w tkance miękiszowej liścia.

Indukcja:

• wolne rodniki

• NO - jego pojawianie się następuje bardzo wcześnie (ok. 10 dnia rozwoju liści). Pojawia się w cytoplazmie i mitochondriach. Tworzy kompleks ze specyficznym rodzajem fluorochromu.

Zmiany potencjału błonowego nie indukują. Zarówno w młodych, jak i starych częściach, są komórki z prawidłowym potencjałem i ze zmienionym.

PCD w mezofilu:

• fragmentacja DNA

• kondensacja chromatyny i pojawianie się NO

• destrukcja organelli

Pośrednikami podczas apoptozy są aktywne formy tlenu, czyli np. NO, hormony roślinne i określony poziom metabolitów, np. węgla.

Apoptoza (2)- połowa dwudziestego wieku - odkryto, że śmierć konieczna do eliminacji niektórych tkanek, aby inne mogły się rozwinąć - odkryto to w sześćdziesiątych latach.

Pierwsze białko proapoptotyczne pochodziło z Ceanorhabdidis elegans - Bcl9, a później odkryto homolog genu u człowieka - Bcl2. Ukoronowanie odktyć - 2002 nobel - genetyczna regulacja rozwoju organów i programowana śmierć komórkowa. Czy apoptoza jest tym samym, co PCD? W odniesieniu do zwierząt tak. Natomiast nie mówi się o apoptozie u roślin. Nekroza - niekontrolowana śmierć - wskutek czynników zapalnych - chemicznych, fizycznych. Ostatecznie prowadzi to do lizy komórki.

W tej chwili wiadomo ogólnie, że PCD jest stałe ewolucyjnie i geny u C. elegans są zbliżona pod względem budowy aż do człowieka. Proces konserwowany ewolucyjnie.

Podczas apoptozy - komórka się kurczy, wyrzucanie ciałek apoptotycznych. Jeśli się przyjrzeć prawidłowej komórce i apoptotycznej, to widać, że w morfologii jądra, którego chromatyna ulega kondensacji, zmiany w mitochondriach - zmiana przepuszczalności błon, zmiany w przepuszczalności błony cytoplazmatycznej - są to zmiany jednakże krokowe. Kończą się powstawaniem ciałek apoptotycznych, a więc odpączkowywaniem z komórki umierającej zawartości obłonionych. Jeśli patrzymy na morfologię komórek ulegających nekrozie, to o ile apoptotyczne się kurczą, to w nekrozie pęcznieją wskutek niekontrolowanej utraty przepuszczalności błon. Taka komórka puchnie, bo jest dziurawa i nabiera wody - dochodzi do jej dezintegracji i jej strawienia. W tej chwili jest szereg znanych białek, genów kodujących białka proapoptotyczne i antyapoptotyczne. Najbardziej znana z genów białek antyapoptotycznych jest funkcja genu Bcl2 i genu BAX i BAK, które kodują białko proapoptotyczne. Aby komórka kończyła swój żywot na drodze apoptozy potrzeba dużo ATP, odpowiedni potencjał utleniająco-redukcyjny, czyli czynniki do prawidłowej aktywności rozmaitych enzymów. Może wówczas dojść do ekspresji określonych genów, które produkują białka śmierci i części zmian biochemicznych... a więc kondensacja cytoplazmy, chromatyny, fragmentacja DNA, zmiana przepuszczalności mitochondrium, wywalenie cytochromu C i rozdziału komórki na ciałka apoptotyczne. W przeciwieństwie do apoptozy, czynniki, które prowadzą do nekrozy to czynniki mechaniczne i związki toksyczne. Dlaczego komórki ulegają apoptozie? Apoptoza jest normalnym procesem, który jest konieczny i do utrzymania odpowiedniej ilości komórej, normalnego rozwoju, zapobiegania infekcjom. Komórki ulegają apoptozie, żeby inne elementy mogły się rozwinąć. Takie przykłady to np.: resorpcja ogona kijanki podczas metamorfozy żaby - w określonym momencie rozwoju żaby ogon odpada - ale ten proces jest kontrolowany genetycznie i nie zachodzi dowolnie kiedykolwiek. Inne - zanikanie tkanki pomiędzy palcami u płodu. Apoptoza w jakimś sensie usuwa nadmiar komórek w trakcie rozwoju mózgu. Drugi motyw to konieczność stałęgo odtwarzania tkanek - jedne obumierają, inne się tworzą, np. krwi, czy nabłonkowe. III powód - niszczenie komórek, które zagrażają integralności organizmu. Może być śliska granica między nekrozą i apoptozą, bo pewne czynniki nekrotyczne mogą powodować apoptozę. Ale infekcja przez wirusy, czy pasożyty indukuje apoptozę. Przykład to niszczenie komórek przez limfocyty T (gdy zainfekowane przez wirusy), czy też niszczenie komórek, gdzie uszkodzone DNA. Dlaczego? Bo dochodzi do intensywnej produkcji białka p53, które indukuje apoptozę. Jeśli dojdzie do uszkodzenia DNA, natychmiast silnie p53 się akumuluje, który dalej prowadzi komórkę na ścieżkę apoptozy. Może być tak, że przy niskim poziomie uszkodzeń, komórka może wyjść z tego cyklu. Co się dzieje, gdy p53 jest zmutowane? Komórka nie może dojść do apoptozę, a wchodzi na drogę nowotworzenia i przekształca się w nowotworową. Generalnie o rozpoczęciu apoptozy może decydować to, że dojdzie do nadmiaru pewnych negatywnych sygnałów (np. wzrost ROS, czy kumulacji białek, które mają nieprawidłową strukturę przestrzenną) lub niedobór pozytywnych sygnałów - np. hormonów, to z kolei może także rozpocząć się apoptoza, a więc przyczyn bardzo wiele. Generalnie przebieg apoptozy wygląda tak, że może być ona regulowana przez tzw. szlak zewnętrzny receptorowy lub wewnętrzny. Po otrzymaniu sygnału zewnętrznego, dochodzi do uaktywniania kaspaz - proteaz cysteinowych, które mają własności proteolityczne i są istotnym białkiem apoptotycznym. Zwykle pewne kaspazy funkcjonują na początku, one uruchamiają kaspazy wykonawcze i dochodzi do apoptozy. Wewnętrzny szlak aktywacji jest zwany mitochondrialnym. Szlak zewnętrzny jest to taki, którego sygnały są odbierane przez receptory transbłonowe błony komórkowej, które należą do TNF - Tumor Necrotic Factor. Szlak wewnętrzny - sygnał odbierany od wewnątrz i powoduje zaburzenie potencjału transbłonowego mitochondium, zmianę przepuszczalności mitochondrium, wydostanie się rozmaitych białek - najważniejsze to cytochrom C i uruchomienie kaskady kaspaz. Tak więc porównując oba szlaki, to przynajmniej patrząc na to makroskopowo, główny schemat jest podobny - uruchamianie proteaz cysteinowych, które uruchamiają inne kaspazy i prowadzą do apoptozy. W zewnętrznym szlaku początek szlaku jest inny, bo albo są receptory transmembranowe i one powodują powstanie kompleksu, który w sktócie nazywa się DISC - Death inducing signalling compleks -tworzenie liganda i receptora, jako kompleksu, który posiada domenę śmierci lub w przypadku wewnętrznego szlaku - zanim zostaje uruchomiona kaskada kaspaz, tworzy się struktura analogiczna do DISC ... apoptosom. Generalnie, jeśli patrzeć na te dwa schematy, to fazą wykonawczą są kaspazy.

Szlak zewnętrzny - ligand łączy się z receptorem FAS. Ligand rozpoznaje receptor i tworzy się DISC - w szczególnych przypadkach nosi nazwę FAD - FAS+domena śmierci. Dochodzi do aktywacji kaspazy ósmej, która stymuluje resztę kaspaz. Inny przykład receptora TNF - też tworzy DISC, który także aktywuje kaspazę 8 i to prowadzi do aktywacji kaskady kaspaz.

Szlak wewnętrzny - mitochondrialny. Jakiś sygnał wewnętrzny - może być to wzrost ROS, co indukuje zmiany na powierzchni błony mitochondrialnej. Znajduje się tam białko APAF1. Białko Apaf1 chronione jest zwykle poprzez jedno z białek antyapoptotycznych Bcl2. Jak się spojrzy na nie, to one współistnieją. Białko BCL2 chroni powierzchnię mitochondrium przed wniknięciem czynników do wnętrza mitochondrium. Jeżeli sygnał indukuje apoptozę, to sygnał ten zwykle powoduje rozsprzęgnięcie tych dwóch białek i oddalenie się białka Bcl2 i wobec tego swobodny białek proapoptotycznych do mitochondriów. Te białka - Bax i Bak wnikają do mitochondrium. One indukują zmiany potencjału transbłonowego mitochondrium, zwiększa się przepuszczalność i wypływ białek z przestrzeni międzybłonowej. Jednym z takich białek jest cytochrom C. Cyt c wskutek tej sekwencji zdarzeń wypływa do cytoplazmy i wraz z białkiem Apaf1 i kaspazą 9 tworzy apoptosom. Apoptosom jest pośrednim ogniwem aktywującym kaspazy. Często ta kaspaza jest w formie prokaspazy - nieaktywnej. Kaspaza 9 zostaje uruchomiona i cała reszta kaspaz zostaje uruchomiona i zaczyna się disco. Apoptosom jest strukturą o tyle ciekawą, że ma formę kołowej platformy i ma siedmiokrotną budowę - siedem monomerów. Oprócz tego jest prokaspaza 9 i cytochrom c - tworzy to strukturę przypominającą pogański manifest idei koła. Tworzenie apoptosomu jest krokowe - białko Apaf1 składa się z domen i ma sektory, które łączą się z innymi czynnikami, które tworzą apoptosom. Jedna domena łączy się z kaspazą, inna do cytochromu, a jeszcze inna indukuje proces oligomeryzacji. Najpierw przyłącza się cyt c i tworzy się monomer, która później jest siedmiokrotnie powielana - białko apaf1, cyt C i kaspaza 9. Budowa apoptosomu - są różne koncepcje. Wspólne jest to, że ma siedmiokrotną budowę. Istotna rzecz jest taka, że kaspazy to proteazy cysteinowe i występują w formie proenzymów w cytoplazmie. Znanych jest 14 kaspaz i to, co ważne, to to, że inna grupa tworzy kaspazy inicjujące, a inna grupa to kaspazy wykonawcze - czyli te, które powodują cięcia w białkach. To, co dobrze zapamiętać, to kaspazy inicjujące - w przypadku szlaku zewnętrznego, kaspazą inicjującą była kaspaza ósma. Natomiast w szlaku mitochondrialnym, to co wchodzi w skład apoptosomu, czyli struktury, która inicjuje aktywność kaspaz - (pro)kaspaza9. Zupełnie inne są aktywowane przez inicjujące - tu najlepiej są poznane kaspazy 3 i 6. W pozostałych przypadkach jest znak zapytania - do końca rola nieznana. Zupełnie inaczej są aktywowane kaspazy inicjatorowe i kaspazy egzekutorowe. W przypadku inicjatorowych, a więc 9-tej i ósmej, ich aktywacja zachodzi przez dimeryzację. Tworzenie dimerów powoduje aktywację. W przypadku kaspaz egzekutorowych - np. siódmej, czy 3 - są aktywowane inaczej...dzięki rozdziałowi na małą i dużą podjednostkę. A więc najpierw jest cięcie, które odcina, które odcina N-terminalny peptyd i dzieli kaspazę na małą i dużą podjednostkę. Jeśli patrzymy na część centralną szlaków, to kolejne aktywacje kaspaz - ósma uruchamia trzecią, dziewiąta siódmą. Uruchamiają się endonukleazy, które tną DNA itd. Istotnym elementem apoptozy jest fragmentacja DNA. Jednym z wyznaczników apoptozy jest specyficzna dla apoptozy internukleosomalna fragmentacja DNA - między nukleosomami - to odróżnia apoptozę od nekrozy, bo w nekrozie cięcia są przypakowe. W przypadku apoptozy, wszystko cięte przez specyficzne endonukleazy. JA kstwierdzić, że ta fragmentacja specyficzna? Szereg metod: jedna z nich to elektroforeza pojedynczych komórek, czyli nie całego ekstraktu, który się umieszcza na żelu i dochodzi do rozdziału faz, lecz pojedyncze komórki poddaje się elektroforezie na szkiełkach i patrzymy, czy jest fragmentacji. Jeżeli kuliste - komórka młoda, nie uległo nic fragmentacji. Jeżeli dostaniemy obraz przypominający kometę, to znaczy, że doszło do fragmentacji DNA. W nekrozie smiry. Można badać intensywność świecenia DNA - fluorochromu, którym się to barwi, jest proporcjonalna do zawartości DNA i można sprawdzić, jaka ilość została pofragmentowana.

Apoptoza może być wynikiem zakażeń wirusowych, bakteryjnych, pasożytniczych. W wielu wypadkach wirusy mogą indukować apoptozę, np. wirus HIV indukuje aktywność proapoptotyczną. HErpes virus wzmaga białka z grupy Bcl2 - nowotworzenie. W przypadku bakterii, niektóre uszkadzają błonę śluzową żołądka - Helicobacter pylori. Trypanosoma i Toxoplasma, wreszcie niektóre helminty.

PCD u roślin

wiadomo mniej, niż u zwierzątek. Nie używa się terminu apoptoza, dlatego, że z tego, co wiadomo, a gówno wiadomo, nie zawsze jest kontrola tych samych genów, które funkcjonują u zwierząt. Dlaczego tak jest? Jest inny rozwój roślin i zwierząt. Struktura i metabolizm też inne. W przypadku roślin, przynajmniej plastydy, wakuole i ściana komórkowa sprawiają, że metabolizm jest nieco różny. Trzeci argument... inna regulacja hormonalna. Tu przez fitohormony, a tam hormony innego typu. Nie stwierdzono homologów zarówno białek pro i antyapoptotycznych, ani nie znaleziono homologów kaspaz. Aczkolwiek są białka kaspazopodobne i białka Bcl2-podobne. Mają duży stopień homologii, ale nie są identyczne. To, co jest wspólne w obu procesach, to to, że są bardzo powszechne. I w trakcie rozwoju i odtarzania generacji komórek i reakcji na zakażenia i zareżanie funkcjonują te procesy także u roślin. A więc zarówno w fazie embrionalnej, jak i w organach generatywnych i wegetatywnych. Np. degeneracja megaspor, denegeracja tapetum (warstwa odżywcza ziaren pyłku) przykłady PCD. Inne przykłady - np. PCD elementów naczyniowych, czyli takich, którymi roślina przewodzi wodę, które początkowo mają normalne protoplasty, ale ostatecznie ich wnętrze zamiera i pozostaje ściana komórkowa i jest bardzo dobry przepływ pomiędzy poszczególnymi naczyniami. Są dwa wspólne wyznaczniki PCD i apoptozy - jeden z nich, to internukleosomalna fragmentacja DNA i która zachodzi u roślin również. Kondensacja chromatyny - dochodzi w określonym etapie do kondensacji. Internukleosomalna fragmentacja poprzedza fragmentacje chromatyny. Zmiany strukturalne jądra po to, aby pokazać, że chromatyna jest rozproszona, a później skondensowana... i wiadomo, o co chodzi. W liściu początkowo w jądrach rozproszona chromatyna, a w starych liściach są wyraźne elementy skondensowane. Liść o tyle fajną strukturą, że ma chloroplasty. Test kometkowy też można wykonać - im starszy liść, tym ten stopień fragmentacji większy. Poza tymi dwoma elementami, czyli fragmentacją DNA i kondensacją chromatyny jest pytanie - czy mitochondria biorą udział u roślin w indukcji PCD... otóż do końca niewiadomo. W kolejnych klatkach pokazywano mitochondria. Barwiąc mitochondria fluorochromami można sprawdzić jaki mają stan transbłonowy. Czerwony kolor - wysoki potencjał, zielony - niski. Występują zarówno populacje mitochondriów z zielonym i czerwonym... są więc i takie i takie formy na różnych etapach rozwoju. Wobec tego wniosek ostatecznie właściwie jest taki, że zarówno w młodych mitochondriach i starych są populacje z wysokim i niskim potencjałem, dlatego też można powiedzieć, że prawdopodobnie nie można mitochondrium traktować, jako ośrodka przekazywania sygnałów apoptotycznych...

PCD - co wiadomo, a czego nie? Wiadomo, że induktorem mogą być jak u zwierząt - zmiany rozwojowe i środowiskowe. Poziom ROS, metabolitów itd. Podobna internukleosomalna fragmentacja i kondensacja chromatyny. W chloroplastach fragmentacja chloroplastowego DNA i degradacja struktury. W mitochondriach - czy wypływ cytochromu c? niewiadomo. Znaleziono białka o dużym stopniu homologii do kaspaz, ale wciąż to nie są do końca kaspazy... a białka ANALOGICZNE.

---