Grupa VI, .04.2008 r.

Wykonano przez:

Temat ćwiczenia:

Analiza aminokwasów metodą chromatografii jonowymiennej przy użyciu analizatora AAA 400 [Ingos]

1. Wstęp teoretyczny

Chromatografia jonowymienna to rodzaj cieczowej chromatografii kolumnowej. Jest to metoda preparatywna używana do wydzielenia z mieszaniny żądanej substancji.W tej metodzie chromatografii faza stacjonarna, złoże, jest obdarzona ładunkiem. Stanowi je zazwyczaj żywica jonowymienna, zawierająca obdarzone ładunkiem grupy funkcyjne, oddziałujące z przeciwnie naładowanymi grupami związków, które mają zostać zatrzymane przez nośnik:

• pozytywnie naładowany jonowymieniacz (anionit) wiąże aniony

• negatywie naładowany jonowymieniacz (kationit) wiąże kationy.

Związki związane z jonowymieniaczem mogą być wymyte z kolumny przez stopniową elucję, a także poprzez zmianę stężenia soli lub pH.

Tego rodzaju chromatografii używa się do oddzielania takich związków jak aminokwasy, peptydy i białka. Chromatografia jonowymienna jest powszechnie stosowana do oczyszczania białek w systemie FPLC.

Wartości pomiarów detektora rejestrowane są przez komputer widoczne w postaci pików.

2. Cel ćwiczenia

Ilościowa analiza aminokwasów siarkowych

3. Wykonanie

Aminokwasy siarkowe użyte do ilościowej analizy to cysteina i metionina.

Przeprowadzono analizę próbki, wykorzystując program analizatora o parametrach:

1. Regeneracja i równoważenie kolumny (regeneracja 0,2 M NaOH, równoważenie buforem cytrynianowo - sodowym, pH 3,0)

2. Rozdział chromatograficzny i elucja buforem cytrynianowo - sodowym - pH 3,0, temperatura kolumny - 60 ⁰C. Odczynnik do post - kolumnowej reakcji ninhydrynowej dozowany był automatycznie. Na podstawie chromatografu roztworu wzorcowego zidentyfikowano aminokwasy w próbce: 1 pik - cysteina, 2 pik - metionina

4. Wyniki

Parametry dla prób wzorcowych:

a). Cysteina- stężenie C= 250 µmoli/mililitr

pole powierzchni pod pikiem 34.3609

b). Metionina- stężenie C= 250 µmoli/mililitr

pole powierzchni pod pikiem 35.6151

Obliczenie stężeń w badanych próbkach:

Obliczenia wykonano korzystając z proporcji:

pole powierzchni pod pikiem wzorca - stężenie wzorca (µmoli/mililitr)

pole powierzchni pod pikiem badanej próbki - X µmoli/mililitr

dla cysteiny

pole powierzchni pod pikiem 9.9745

C=72.57 µmoli/mililitr

dla metioniny

pole powierzchni pod pikiem 8.6668

C=60.84 µmoli/mililitr

5. Dyskusja wyników

1. Dla cysteiny

C = 62.5 µmoli/mililitr - rzeczywiste stężenie w próbce

x = 72.57 µmoli/mililitr

Błąd bezwzględny:

Błąd względny:

2. Dla metioniny

C = 62.5 µmoli/mililitr - rzeczywiste stężenie w próbce

y = 60.84 µmoli/mililitr

Błąd bezwzględny

Błąd względny:

Stężenia, które otrzymaliśmy, różnią się od rzeczywistych stężeń aminokwasów w próbce, ponieważ do obliczeń uwzględniono dane tylko jednego roztworu wzorcowego. Gdyby było więcej próbek można by było sporządzić krzywą kalibracji, co pozwoliłoby dokładniej obliczyć stężenia badanych aminokwasów.

---