Techniki kultur in vitro
Zastosowanie:
cele praktyczne:
-masowe rozmnożenie roślin,
-hodowla roślin:
--otrzymywanie roślin haploidalnych i linii DH,
--indukowanie zmienności somaklonalnej i tworzenie materiałów wyjściowych dla hodowli,
--selekcja genetypów odpornych na stresy biotyczne i abiotyczne,
--otrzymywanie mieszańców miedzygatunkowych przy występowaniu barier pre i postzygotycznych,
--zapłodnienia in vitro,
--transformacji genetycznej,
-pozyskiwanie cennych metabolitów (surowce do produkcji leków i kosmetyków),
cele naukowe:
-badania podstawowe (genetyka, fizjologia, biochemia, biologia molekularna).
KULTURY IN VITRO
Kultury organów, tkanek, pojedynczych komórek na sztucznych podłożach (płynnych lub zestalonych agarem), w naczyniach szklanych, przy zachowaniu pełnej sterylności w ściśle kontrolowanych warunkach świetlnych i termicznych.
Totipotencja
Zdolność każdej komórki do odtworzenia całej rośliny, wynikająca z posiadania pełnej informacji genetycznej.
Kultury in vitro pozwalają na:
nieograniczone w czasie prowadzenie doświadczeń
ścisłą kontrolę warunków prowadzenia kultury
a obiekty wyizolowane z rośliny macierzystej są pozbawione działania jakichkolwiek czynników korelacyjnych
Przygotowanie materiału roślinnego:
zdrowotność materiału roślinnego
termin pobierania fragmentu rośliny (istotne dla gatunków przechodzących okres spoczynku)
wiek rośliny matecznej
jej stan fizjologiczny (optymalne warunki wzrostu)
Wybór fragmentu roślin:
Najczęściej :
- tkanki młode np. merystematyczne - genetycznie wyrównane
merystemy wierzchołkowe - produkcja roślin wolnych od patogenów
- cebule i bulwy (duża zdolność do regeneracji)
- szypułki kwiatostanowe
- kwiatostany (Asteraceae zawierają liczne merystemy)
- fragmenty liści
Rzadziej używa się części podziemnych - trudności w odkażaniu
Pożywka
skład zależy od gatunku rośliny, rodzaju eksplantatu, szybkości wzrostu i indukcji organów
White (1943) Chu (1978) - N6
Murashige and Skooga (1962) - MS Gamborg (1968) - B5
Linsmaier and Skooga (1965) - LS Nitch and Nitsch (1969) - NN
SUBSTANCJE MINERALNE
makroelementy (N, S, P, K, Na, Mg, Ca, Fe)
mikroelementy (B, Cu, Mn, Mo, Zn, Co, I, Al, Ni, Ti)
SUBSTANCJE ORGANICZNE
witaminy (tiamina /wit. B1/, kwas nikotynowy /wit. PP/, pirydoksyna /wit. B6/, biotyna /wit. H/, kwas: foliowy, askorbinowy, pantotenowy)
aminokwasy (glicyna, glutamina, hydrolizat kazeiny)
regulatory wzrostu auksyny (cytokininy, gibereliny, kwas abscysynowy (ABA), etylen, poliamidy, jasmonidy, brasinosteroidy)
cukry
substancje zestalające
Makroelementy
AZOT - podst. składnik białek, enzymów, aminokwasów, kw. nukleinowych
do pożywek w formie nieorganicznej (azotanowej i amonowej)
organicznej (aminokwasy, białka)
SIARKA - w skład aminokwasów, białek, witamin H, B1
do pożywek w formie siarczanów
FOSFOR - w cukrach, kw. nukleinowych, do pożywek fosforan amonu lub wapnia
POTAS - w syntezie białek i przemianach cukrowców (aktywator wielu enzymów), w
procesie fotosyntezy, do pożywek azotany, chlorki, fosforany
SÓD - uczestniczy w utrzymaniu ciśnienia osmotycznego, do pożywek molibdenian sodu
MAGNEZ - w chloroplastach, rybosomach, mitochondriach, udział w fotosyntezie i oddychaniu, aktywuje wiele enzymów, do pożywek siarczan magnezu
WAPŃ - do budowy ścian komórkowych i transportu substancji wzrostowych, utrzymuje prawidłową strukturę błon cytoplazmatycznych, do pożywek chlorek wapnia
ŻELAZO - w mitochondriach i chloroplastach, w procesach oksydacyjno-redukcyjnych, do pożywek związki chelatowe:
kompleks żelaza z kw. etylenodwuaminoczterooctowym (FeEDTA) lub
sól sodowo-żelazowa tego kwasu (NaFeEDTA)
Mikroelementy
BOR -w budowie ścian komórkowych, w metaboliźmie kwasów nukleinowych, w przemianach węglowodanów i ich transporcie, do pożywek kwas borowy
MIEDŹ - w wielu enzymach, w fotosyntezie i przemianach tłuszczowców, do pożywek siarczan miedzi
MANGAN - aktywator wielu reakcji, udział w fotolizie wody, utrzymanie równowagi oksydacyjno-redukcyjnej, do pożywek siarczan manganowy
MOLIBDEN - w przemianach azotu, w syntezie kwasu askorbinowego, w metaboliźmie zw. fosforowych, do pożywek sole molibdenianowe
CYNK - we wszystkich strukturach komórkowych, udział w syntezie IAA, w metaboliźmie białkowym i oddychaniu, do pożywek siarczan cynku
Skład pożywki uzupełnia się śladowymi ilościami:
KOBALT - w skład wit. B12, udział w procesach metabolicznych (w wiązaniu azotu), do pożywek chlorek kobaltu
JOD - aktywator enzymów, do pożywek jodek w jodku potasu
GLIN - wpływa na pęcznienie cytoplazmy i aktywność enzymów w cytoplaźmie,
do pożywek chlorek glinu
NIKIEL i TYTAN - udział w oddychaniu, do pożywek chlorek niklu i siarczan tytanu
Witaminy
tiamina (wit.B1) 0,1 - 1,0 mg ·dm-3
pirydoksyna (wit.B6) 0,1 - 1,0 mg ·dm-3
biotyna (wit.H) 0,1 - 1,0 mg ·dm-3
kwas nikotynowy (wit.PP) 0,5 - 1,0 mg ·dm-3
kwas foliowy 0,01- 0,1 mg ·dm-3
kwas askorbinowy (wit.C) 1,0 - 100 mg ·dm-3
kwas pantotenowy (wit.B5) 0,1 - 1,0 mg ·dm-3
Aminokwasy
dodatek wpływa korzystnie na rozwój roślin, zwłaszcza kultur zarodków
cysteina, glicyna, glutamina, histydyna, prolina
Regulatory wzrostu
grupa związków organicznych działających stymulująco lub hamująco na procesy wzrostu i rozwoju roślin
AUKSYNY
syntetyzowane w merystemach wierzchołkowych pędu i korzenia, hamują rozwój pąków bocznych (zjawisko dominacji wierzchołkowej)
W kulturach in vitro indukują:
wzrost wydłużeniowy komórek i organów
regeneracja brakujących organów
tworzenie zawiązków korzeni
namnażanie tkanki kalusowej
Najczęściej stosowane auksyny:
naturalne: IAA kwas indolilo-3-octowy
IBA kwas indolilo-3-masłowy
PAA kwas fenylooctowy
- syntetyczne: NAA kwas naftylo-1-octowy
2,4-D kwas 2,4—3,6-dichlorobenzoesowy
Picloram kwas 4-amino-3,5,6-trichloropikolinowy
Dicamba kwas 2-metoksy-3,6-dichlorobenzoesowy
0,001- 10,0 mg·dm-3
CYTOKININY
W kulturach in vitro:
indukują podziały i różnicowanie się komórek
syntetyzowane głównie w korzeniach, transportowane do części nadziemnych
indukują tworzenie pąków bocznych (zmniejszanie dominacjiwierzchołkowej)
hamują ukorzenianie
Najczęściej stosowane cytokininy:
naturalne: Zea zeatyna
2iP 6(ၧ,ၧ-dimetyloalliloamino)puryna
syntetyczne K kinetyna
BA (BAP) benzyloaminopuryna
BPA tetrahydropiranylobenzyloadenina
TDZ tidiazuron
0,1 - 40,0 mg·dm-3
GIBERELINY
tworzą się w młodych liściach i pędach, kwiatach i kiełkujących zarodkach
W kulturach in vitro
- stymulują wydłużanie i podziały komórkowe
- hamują wzrost pąków bocznych (stymulują wzrost pąka głównego)
- przyspieszają kwitnienie i przerywają spoczynek
Do pożywek: GA3 kwas giberelinowy
niski stosunek auksyn do cytokinin stymuluje namnażanie pędów :
przybyszowych
wierzchołkowych
wysoki stosunek auksyn do cytokinin stymuluje:
ukorzenianie pędów
embriogenezę
inicjację tkanki kalusowej
POLIAMINY
wpływają na tworzenie się zarodków somatycznych, korzeni przybyszowych, pędów
JASMONIDY
hamują embriogenezę, powstanie kalusa
BRASINOSTEROIDY
stymulują wzrost i wydłużanie się komórek, przyspieszają starzenie się komórek w zamierających hodowlach tkankowych
KWAS ABSCYSYNOWY ABA
- hamuje tworzenie elementów drewna i łyka oraz przedwczesne kiełkowanie zarodków
ETYLEN
- hamuje wzrost, przyspiesza dojrzewanie nasion
Cukry
są głównym źródłem węgla i energii, wpływają na potencjał osmotyczny komórki
sacharoza 10 - 30 g · dm-3
glukoza, 30 - 40 g · dm-3
inozytol - alkoholowa pochodna cukrów prostych 100 - 500 mg · dm-3
Inne składniki
Węgiel aktywowany - absorbuje substancje aktywne i inhibitory
Substancje zestalające
Agar - polisacharyd zbud. z galaktozy, składnik ścian kom. niektórych glonów
0,6 - 1 %, przy pH <4,5 płynny
Phytogel, Gelrite - polimery z bakterii
WŁAŚCIWOŚCI CHEMICZNE I FIZYCZNE POŻYWKI
Kwasowość
- wpływa na dostępność i pobieranie składników
pH 5,5 - 6,0 ustala się przed dodaniem agaru i przed autoklawowaniem
Stopień zestalenia pożywki
- zależy od gatunku, rodzaju i stadium rozwoju eksplantatu
pożywki płynne, półpłynne i stałe
Warunki sterylne
- wolne od form wegetatywnych i przetrwalnikowych mikroorganizmów patogenicznych (grzybów, bakterii, wirusów).
Sterylizacja
procedura gwarantująca zabicie wszystkich żyjących organizmów, łącznie z endosporami i wirusami
Ogrzewanie płomieniem
Sterylizacja gorącym powietrzem
Sterylizacja gorącą parą wodną (autoklaw - 121ႰC, 1 atm., 20 min.)
Sterylizacja promieniami jonizującymi (ၢ, ၧ, X)
Sterylizacja przez filtrację (filtr membranowy z octanu celulozy, poliwęglanu)
Sterylizacja z użyciem zw. chemicznych - w specjalistycznych instytucjach - tlenek etylenu rozcieńczony azotem lub węglem, aldehyd glutarowy, nadtlenek wodoru
Dezynfekcja
procedura inaktywacji, zniszczenia lub usunięcia potencjalnie szkodliwych mikroorganizmów (nie niszczy endospor bakteryjnych)
Środki chemiczne bakteriobójcze lub bakteriostatyczne
fenol, chlor, podchloryny (niszczą endospory)
Sposoby sterylizacji lub dezynfekcji
laboratorium in vitro:
70% alkohol etylowy (blaty)
handlowe środki bakterio- i grzybobójcze (podłogi)
lampy UV (komory z laminarnym przepływem powietrza)
szkła i instrumentów:
autoklaw
suszarki (temp. 130-170 ႰC / 2-4 godz.)
70% alkohol etylowy + opalanie w płomieniu
promienie jonizujące (szalki, strzykawki)
pożywek:
autoklaw
sterylne filtry
Odkażanie materiału roślinnego
wybór odczynnika dezynfekującego, jego stężenie i czas działania zależą od wrażliwości tkanek odkażanego eksplantatu oraz od stopnia porażenia przez drobnoustroje
Etapy odkażania:
Oczyścić eksplantat z obumarłych części, wosku, włosków itp.
Zanurzyć w 70% alkoholu etylowym (30 sek.)
Umieścić w środku odkażającym z dodatkiem Tween20, Ludwik -
lepiej wydłużać czas odkażania niż zwiększać stężenie
4. Trzykrotne płukanie w sterylnej, destylowanej wodzie (po 5 min.)
Środki stosowane do odkażania materiału roślinnego:
-alkohol etylowy, chloramina, nadtlenek wodoru, podchloryn sodu, wapnia, woda bromowa, preparaty handlowe (ACE, DOMESTOS)
Kontrolowane warunki prowadzenia kultury
Temperatura: 18-28ºC, Światło: 30-70 µM m-2 s-1, Fotoperiod dobowy: 16+8 h (dzień+noc)
Wyposażenie laboratorium in vitro
PRZYGOTOWALNIA POŻYWEK
WAGI, MIESZADŁA, PHMETR, AUTOKLAW
PRZESZCZEPIALNIA
KOMORA DO PRAC STERYLNYCH, WIRÓWKI
FITOTRON
MYJNIA