Ćw. nr 2 Wysoko sprawna chromatografia cieczowa. Oznaczenie fenolu za pomocą chromatografii cieczowej.

I Wstęp teoretyczny

HPLC (ang. High Performance Liquid Chromatography - wysokosprawna chromatografia cieczowa) - to metoda analityczna a także preparatywna, służąca do oczyszczania i identyfikacji substancji chemicznych.

Jest to rodzaj cieczowej chromatografii kolumnowej. Oznacza to, że analizowana próbka, jest rozpuszczana w rozpuszczalniku transportującym (tzw. eluencie) i w tej formie jest kierowana na kolumny, które wypełnione są specjalnym złożem porowatym lub żelowym. Na skutek oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi tworzącymi analizowaną próbkę a wypełnieniem kolumny następuje ich rozdział. Te związki chemiczne, które silniej oddziałują ze złożem (mają tzw. większe powinowactwo do złoża) przepływają wolniej przez kolumnę, zaś związki chemiczne, które oddziałują słabiej przepływają szybciej.

HPLC różni się od zwykłej chromatografii cieczowej ciśnieniem pod jakim podawany jest eluent na kolumny. Są to dość znaczne ciśnienia, przekraczające 100 atm. Dzięki takiemu ciśnieniu złoże w kolumnach HPLC może być bardziej "upakowane" niż w kolumnach do zwykłej, niskociśnieniowej chromatografii cieczowej, co powoduje znacznie lepszy rozdział analizowanych mieszanin na poszczególne związki chemiczne, w znacznie krótszym czasie, przy mniejszym zużyciu eleunta i mniejszej ilości analizowanej próbki. Zdolności rozdzielcze HPLC są zbliżone, a nawet czasem większe od zdolności rozdzielczych chromatografii gazowej.

W HPLC duże znaczenie dla rozdziału ma polarność faz. Początkowo, stosowano normalny układ faz ( NP), w którym faza stacjonarna jest znacznie bardziej polarna niż faza ruchoma (Np. układ: żel krzemionkowy - heksan). Obecnie stosuje się odwrócony układ faz (RP), w którym faza stacjonarna jest niepolarna, a faza ruchoma polarna [Np. układ: żel krzemionkowy z modyfikowaną powierzchnią (grupy oktadecylowe tzw. szczotka oktadecylowa) - mieszanina metanolu i wody]. Układy RP mają bardziej trwałe wypełnia, cechują się niższym kosztem fazy ruchomej.

Aparaty HPLC składają się zwykle z:

• zbiornika na eluent (1)

• pompy, zapewniającej stałe ciśnienie bądź stałe natężenie przepływu eluenta w układzie (2)

• injektora - przyrządu umożliwiającego wstrzykiwanie analizowanych próbek bez rozszczelnienia układu (zwykle dzięki zastosowaniu tzw. martwej pętli) (3)

• filtrów, zwanych też prekolumnami, które usuwają z eleunta wszelkie zanieczyszczenie, które mogłyby zniszczyć wypełnienie kolumn (4)

• zestawu kolumn z odpowiednim wypełnieniem (5)

• detektora - którym jest zazwyczaj rodzaj uproszczonego spektrometru UV-VIS, spektrometru fluorescencyjnego lub coraz częściej laserowego spektrometru rozproszeniowego (6)

• integratora-który w nowszych aparatach zastępowany jest przez komputer (7)

• zbiornika na zużyty eluent (8a), lub w przypadku aparatów preparatywnych kolektora frakcji (tzw. karuzeli) (8b) - systemu zbiorniczków, które są automatycznie zmieniane, gdy detektor stwierdza wypływ kolejnego rozdzielanego związku chemicznego.

http://zimmer.csufresno.edu/~davidz/Chem102/HPLCpr/HPLCofPR.html

Obecnie coraz częściej stosuje się już także połączenie chromatografu HPLC ze spektrometrem mas:

http://www.pg.gda.pl/chem/Dydaktyka/Analityczna/LC/HPLC_MS_ZASTOSOWANIE_DO_OKRESLENIA_STRUKTURY_TOKSYN.pdf

CHROMATOGRAMY

a)chromatogramy próbki służącej do doboru składu fazy ruchomej:

65% obj. H₂O, 35% obj. acetonitrylu

85% obj. H₂O, 15% obj. acetonitrylu

75% obj. H₂O, 25% obj. acetonitrylu

b) chromatogram próbki wzorcowej

c) chromatogram próbki badanej

---