Antygen (Ag) - makrocząsteczka obca w stosunku do organizmu, do którego wnika, pobudzająca układ immunologiczny do odpowiedzi:

• humoralnej - swoiste przeciwciała

• komórkowej - swoiste komórki efektorowe

Cechy Ag:

- immunogenność: zdolność do wzbudzania odpowiedzi organizmu

- antygenowość: zdolność do reagowania ze wzbudzonymi przez siebie komórkami lub przeciwciałami

Podział Ag:

1.

- grasicozależne - wymagają obecności limfocytów T dla aktywacji limfocytów B do produkcji Ab. Powstają głównie Ab IgG (wysoka swoistość), wzbudzają dobrą pamięć immunologiczną,

- grasiconiezależne - bezpośrednio aktywują limfocyty B, powstają Ab IgM (niska swoistość), wzbudzają słabą pamięć immunologiczną. Superantygeny.

2.

- cząstkowe (korpuskularne) - silnie immunogenne, całe komórki, wirusy

- rozpuszczalne - słabo immunogenne, toksyny, białka, LPS, DNA/RNA

Przeciwciała (Ab) - białka należące do frakcji gammaglobulin syntetyzowane przez komórki plazmatyczne (pobudzone limfocyty B) w przebiegu odpowiedzi immunologicznej, swoiste dla rozpoznawanego Ag.

Schemat przeciwciała:

1. fragment wiążący antygen

2. region Fab

3. region Fc

Powinowactwo (ang. affinity) cecha, która określa siłę wiązania pomiędzy pojedynczym epitopem a pojedynczym miejscem wiązania przeciwciała.

Zachłanność (ang. avidity ) wiązanie się Ab z całą cząsteczką Ag wielodeterminantowego.

Przeciwciała monoklonalne (mAb) - skierowane przeciwko jednej determinancie antygenowej (determinanta=epitop, miejsce wiązania Ag z Ab)

Zastosowanie mAb

W nauce pozwalają:

1. precyzyjnie badać i poznawać nowe struktury na komórkach np. określanie fenotypu

2. badać udział i rozmieszczenie różnych Ag np. Ag glikoproteinowych i glikolipidowych będących regulatorami proliferacji komórek

3. śledzić i poznawać mechanizmy komórkowe i procesy immunologiczne oraz ich zaburzenia np. w transformacji nowotworów

4. badać różne substancje wydzielane przez komórki np. cytokiny, hormony i wykrywać nieprawidłowości w ich produkcji

5. analizować determinanty antygenowe

6. badać strukturę Ab i ich reakcje z Ag

W diagnostyce pozwalają:

1. na bardzo szybkie wykrycie i określenie przynależności gatunkowej szczepów Ag różnych drobnoustrojów w tkance, płynach ustrojowych lub produktach żywnościowych

2. na neutralizację różnych toksyn, blokowania rozpuszczalnych i strukturalnych Ag bakteryjnych, wirusowych i pasożytniczych

3. typować Ag drobnoustrojów

4. typować Ag zgodności tkankowej

5. określać grupy krwi

6. precyzyjnie rozpoznawać niedobory immunologiczne

7. diagnozować choroby nowotworowe

8. mogą być stosowane jako środek immunosupresyjny w przebiegu reakcji transplantacyjnych czy procesów autoimmunologicznych

Plazma - frakcja krwi pozbawiona elementów morfotycznych (krwinek i płytek krwi), ale zawierająca fibrynogen.

Surowica - frakcja krwi pozbawiona zarówno elementów morfotycznych oraz fibrynogenu (pozostałość po oddzieleniu się skrzepu).

Otrzymywanie surowicy:

1. Krew pobrać do jałowych probówek i pozostawić w temp. 37°C na okres 1h w celu utworzenia się skrzepu.

2. Skrzep okroić jałową pipetą od ścianki probówki i pozostawić w temp. 4°C na czas 0,5-24h w celu ściśnięcia się skrzepu i uwolnienia z niego surowicy.

3. Wirować przy 2500 obr/min. w temp. 4°C przez 10 minut.

4. Surowicę wyjałowić przez sączenie jej przez filtry bakteriologiczne o średnicy 2,5um.

5. Surowicę z dodatkiem lub bez środków konserwujących porcjować, zamrozić i przechowywać w temp. -20°C lub -70°C.

Surowica odpornościowa - surowica o dużej zawartości swoistych przeciwciał otrzymana w wyniku naturalnego lub sztucznego uodpornienia określonym antygenem (wirusy, bakterie, toksyny, komórki, fragmenty tkanek antygeny rozpuszczalne, takie jak białka, polisacharydy itp.)

Surowice odpornościowe dzielimy na:

• Surowice monowalentne - zawierają jeden rodzaj przeciwciał o określonej swoistości względem jednego określonego antygenu.

• Surowice poliwalentne - zawierają wiele przeciwciał o różnej swoistości, czyli skierowanych przeciwko różnych antygenom.

Powstawanie odporności jest długotrwałe, dlatego aby uzyskać surowicę odpornościową należy wykonać szczepienie 2-3 miesiące wcześniej.

Surowicę odpornościową wykorzystujemy:

- w celach leczniczych (np. tężec, błonica), powstaje odporność nabyta, która może być czynna (podajemy szczepionkę odpornościową i zmuszamy organizm do produkcji Ab) lub bierna (podajemy gotowe Ab np.w celu zablokowania toksyny, gdy nie ma czasu uodparniać organizmu)

- w diagnostyce chorób: zakaźnych (wykrywanie Ag cząstkowych w materiale badanym, toksyn, określanie serotypów drobnoustrojów itp.), niezakaźnych (testy immunologiczne służące do wykrywania Ag, niedoborów immunologicznych, chorób alergicznych, nowotworów itp.)

- podając osobom z różnymi niedoborami lub defektami odporności

- w kontroli żywności, leków i kosmetyków

- w preparatyce materiałów biologicznych np.surowice odpornościowe skierowane przeciwko Ag komórek, które chcemy wyizolować z danego materiału

Adiuwanty: związki chemiczne lub ich mieszaniny, które podane łącznie z Ag nasilają jego immunogenność, czyli stymulują do szybszej odpowiedzi na ten Ag

• kompletny adiuwant Freuda - zawiera oleje mineralne, emulgator, prątki gruźlicy

• niekompletny adiuwant Freuda - zawiera oleje mineralne i emulgator

• najczęściej stosowane u ludzi:

- wodorotlenek glinu

- polistyren

- toksoidy (gł. błoniczy i tężcowy) - toksyny pozbawione właściwości toksycznych

- liposomy (kulki lipidowe opłaszczające czynnik, który chcemy wprowadzić)

- cytokiny

TESTY DO BADAŃ SUROWIC ODPORNOŚCIOWYCH

1. Precypitacja

- reakcja między cząsteczką Ab swoistego a Ag rozpuszczalnym (o masie cząsteczkowej 40-160kDa) zachodząca w środowisku płynnym

- 1 faza: Ag reaguje z Ab i powstają kompleksy immunologiczne (KI)

- 2 faza: powstałe KI w środowisku elektrolitów wypadają w postaci precypitatów widocznych gołym okiem

- Ag i Ab łączą się ze sobą w różnych stosunkach ilościowych, do powstania kompleksów widocznych gołym okiem dochodzi w strefie ekwiwalencji, czyli strefie równowagi stężeń obu reagentów

Na przebieg tej reakcji wpływają:

• stosunki ilościowe Ab i Ag

• stężenie elektrolitów w środowisku reakcji (optymalne 0,85%NaCl)

• pH środowiska (6,5-8,5)

• temperatura (zależenie od gatunku zwierząt, od których pochodzi surowica odpornościowa, np.. Ab królicze precypitują w temp. 37°C, 20°C i 4°C, a Ab końskie w temp. 37°C

Przed nastawieniem reakcji precypitacji należy pamiętać o inaktywacji surowicy, ze względu na obecność dopełniacza, który może rozpuszczać KI.

Inaktywacja zachodzi w temp. 56°C przez 30 min.

2. Aglutynacja

- reakcja zachodząca pomiędzy swoistymi Ab a Ag cząstkowymi (wchodzącymi w skład otoczek komórek bakteryjnych, grzybów, erytrocytów, komórek ludzkich i zwierzęcych)

- może zachodzić między swoistymi Ab a Ag rozpuszczalnym opłaszczonym na cząsteczkach lateksu

- komórki z przyłączonymi Ab tworzą przestrzenne agregaty wypadające z roztworu w postaci aglutynatu

Test aglutynacji bezpośredniej:

• Wykrywa obecność antygenu w surowicy, plwocinie, wymazie pacjenta

• Kuleczki opłaszczone są przeciwciałami swoistymi wobec wykrywanego Ag

• Wynik pozytywny: aglutynacja

• Wynik negatywny: brak antygenu = brak aglutynacji

Test aglutynacji pośredniej:

• Wykrywa obecność swoistych przeciwciał w surowicy, plwocinie, wymazie pacjenta

• Kuleczki opłaszczone są określonym antygenem

• Wynik pozytywny: aglutynacja

• Wynik negatywny: brak swoistych przeciwciał = brak aglutynacji

Przebieg aglutynacji zależy od:

• pH

• temperatury (aglutyniny "zimne" to przeciwciała klasy IgM, które najlepiej wiążą aglutynogen w zakresie 4-22 stopni Celsjusza, aglutyniny "ciepłe" natomiast są przeciwciałami IgG i wiążą one najlepiej antygeny w temperaturze zbliżonej do naturalnej ciepłoty ciała)

• czasu (zwykle zawiera się w przedziale 15-60 minut)

• siła jonowa (zazwyczaj im mniejsza siła jonowa, tym lepiej aglutyniny łączą się z aglutynogenami)

Aglutynogenami nazywamy cząstki zlepiane podczas aglutynacji przez aglutyniny.

Aglutyniny to przeciwciała biorące udział w zlepianiu aglutynogenów podczas aglutynacji.

• Aglutynacja jest odczynem stosowanym w chorobach zakaźnych, wywoływanych przez bakterie, nie ma natomiast zastosowania w chorobach wirusowych.

• Z najbardziej znanych odczynów należy wymienić odczyn Widala w durze brzusznym, odczyn Weila-Felixa w durze plamistym, odczyn Wrighta w tularemii i w szeregu innych chorób.

• Teoretycznie można go stosować wszędzie tam, gdzie wyhoduje się drobnoustrój, z którego można sporządzić antygen.

• Zaletą odczynu jest prostota jego wykonania, szybkość wystąpienia reakcji, łatwość odczytania wyników i stosunkowo wysoka czułość.

Zastosowanie metody aglutynacji

• w identyfikacji Ag powierzchniowych komórek

• do wykrywania Ag w badanych surowicach

• do oznaczania poziomu Ab w surowicy przez wyznaczenie miana aglutynacyjnego

Miano aglutynacyjne jest to największe rozcieńczenie surowicy badanej (lub najmniejsze stężenie Ag), przy którym widoczne są jeszcze aglutynaty.

3. Hemaglutynacja

• aglutynacja czerwonych krwinek

hemaglutynacja bezpośrednia, czyli czynna, w której zlepianie erytrocytów wywoływane jest przez różne drobnoustroje. To zjawisko może zostać zahamowane działaniem surowicy zawierającej swoiste przeciwciała skierowane przeciwko drobnoustrojom zlepiającym krwinki

hemaglutynacja pośrednia, czyli bierna, zachodzi wówczas, gdy na erytrocyty opłaszczone jakimś antygenem zadziałamy surowicą odpornościową, zawierającą przeciwciała swoiste dla antygenu zaadsorbowanego na powierzchni krwinki.

• odczyn biernej hemaglutynacji wykorzystuje się do określania miana przeciwciał. Wyznacza je dodatnia reakcja antygen - przeciwciało uzyskana z najwyższym rozcieńczeniem surowicy. Może mieć to wartość diagnostyczną w przypadku niektórych choró np. podwyższenie miana może wskazywać na aktywny proces chorobowy.

Konflikt serologiczny- pojawia się w momencie, gdy po raz pierwszy niewielka ilość krwi dziecka dostaje się do krwiobiegu matki (dojdzie do przecieku płodowo-matczynego). Zazwyczaj ma to miejsce dopiero w momencie porodu, gdyż krew dziecka i matki w czasie ciąży nie miesza się dzięki występowaniu między nimi bariery łożyskowej. Po przedostaniu się krwinek Rh(+) do krwiobiegu matki jej organizm zaczyna wytwarzać przeciwciała (typu IgM i IgG), przeciw antygenowi D obecnemu na erytrocytach. Przeciwciała IgG mają zdolność przenikania bariery łożyskowej, w następnych ciążach. W przypadku płodu Rh(+) przeciwciała IgG matki niszczą jego erytrocyty powodując głęboką niedokrwistość. Powoduje to zahamowanie rozwoju płodu. Może doprowadzić do jego obumarcia a następnie poronienia.

Choroba hemolityczna noworodka może pojawić się niekiedy w trakcie trwania pierwszej ciąży (np. jako powikłanie zabiegów wewnątrzmacicznych). Ze względu na szeroko stosowaną profilaktykę są to przypadki sporadyczne, a większość ciąż "konfliktowych" kończy się urodzeniem zdrowego dziecka.

choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi to rodzaj fizjologicznej (choć np. w transplantologii hematologicznej często niepożądanej) reakcji zachodzącej w organizmie biorcy przeszczepupod wpływem wprowadzonych do niego obcych antygenowo limfocytów.

Limfocyty T przyjęte od dawcy naciekają (obce dla nich) tkanki gospodarza i doprowadzają do ich niszczenia. Najczęściej zajmowanymi narządami są skóra, przewód pokarmowy i wątroba. Usunięcie zawiesiny limfocytów z materiału przeszczepowego zmniejsza ryzyko GVHD. Z drugiej strony, nieobecność leukocytów w przeszczepie wzmaga ryzyko reakcji gospodarz przeciwko przeszczepowi i w efekcie odrzucenia przeszczepu.

---