LABORATORIUM 3

Temat: WŁAŚCIWOŚCI BIAŁEK I KWASÓW NUKLEINOWYCH. REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE.

Zadanie 1. Wykrywanie aminokwasów w reakcji z ninhydryną.

Reakcja aminokwasów z ninhydryną jest wykorzystywana do jakościowego i ilościowego oznaczania aminokwasów i wolnych grup NH₃. Aminokwasy reagują z ninhydryną przy wartościach pH powyżej 4, dając produkty o barwie niebieskofioletowej. Intensywność barwy jest proporcjonalna do zawartości wolnych grup α- NH₃ w próbie. W reakcji bierze udział zarówno grupa aminowa jak i karboksylowa. Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu- poprzez iminokwasy do amoniaku, dwutlenku węgla i aldehydu uboższego
o 1 atom węgla. Następnie w wyniku kondensacji 2 cząsteczek ninhydryny: zredukowanej
i utlenionej z amoniakiem powstaje fioletowoniebieskie zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu α- aminowego aminokwasów. Dwa aminokwasy, prolina i hydroksyprolina nie posiadają wolnych grup NH₃, reagują więc inaczej niż pozostałe, dając produkt o barwie żółtej.

• Wykonanie:

Do probówek odmierzyć kolejno po 1 ml:

• 1 % hydrolizatu białka,

• 1% roztworu glicyny,

• 1% roztworu proliny,

• 1% roztworu żelatyny.

-Następnie do wszystkich probówek wlać po 0,5 ml etanolowego roztworu ninhydryny.

-Ogrzewać przez 3 minuty we wrzącej łaźni wodnej.

Po zakończeniu reakcji pojawia się intensywne zabarwienie fioletowe lub żółte w próbach zawierających aminokwasy lub jasnoniebieskie w obecności białka.

Zanotować wyniki i zinterpretować je.

Zadanie 2. Wykrywanie białek i aminokwasów aromatycznych metodą

ksantoproteinową.

Podczas ogrzewania w środowisku stężonego kwasu azotowego aminokwasów aromatycznych i białek zawierających w swoim składzie aminokwasy aromatyczne dochodzi do utworzenia pochodnych nitrowych (związki aci- nitrowe), które w środowisku alkalicznym dają intensywne żółtopomarańczowe zabarwienie.

• Wykonanie:

Do probówek odmierzyć kolejno po 1 ml:

• 1 % hydrolizatu białka,

• 2% roztworu albuminy,

• 1% roztworu tryptofanu

• 1% roztworu glicyny.

-Do każdej próby dodać po 1ml stężonego kwasu azotowego.

-Ogrzewać przez 5 minut we wrzącej łaźni wodnej.

-Po ochłodzeniu probówek należy bardzo ostrożnie (reakcja silnie egzotermiczna!!!), małymi

porcjami, stale mieszając, dodawać 3,5 ml 20% roztworu NaOH.

Po zalkalizowaniu próby pojawia się barwa żółtopomarańczowa.

Zanotować wyniki i zinterpretować je.

Zadanie 3. Wytrącanie białek jonami metali ciężkich.

Jeżeli wartość pH jest większa od pI, cząsteczki białka stają się anionami i mogą reagować z kationami. Kationy metali ciężkich (Fe³⁺, Cu²⁺, Hg²⁺, Pb²⁺) dają z białkami nierozpuszczalne kompleksy, powodując duże zmiany strukturalne w obrębie cząsteczki białka. Wytrącają się osady denaturowanego białka nierozpuszczalne w wodzie ani
w nadmiarze soli.

• Wykonanie:

-Do dwóch probówek odmierzyć po 1ml 0,2% roztworu albuminy.

-Do 1 probówki - dodać parę kropel octanu ołowiu - (CH₂COO)₂Pb (trucizna).

-Do 2 probówki - parę kropel chlorku rtęciowego- HgCl₂ (trucizna).

Zanotować wynik i wyjaśnić przyczyny obserwowanego zjawiska.

Zadanie 4. Wytrącanie białek etanolem.

Rozpuszczalniki organiczne, w tym etanol czy aceton, powodują dehydratację otoczki wodnej wokół cząsteczki białka zmniejszając tym samym jej rozpuszczalność (wypadanie białka z roztworu) oraz wywołując zmiany denaturacyjne w jej obrębie. Jeżeli rozpuszczalniki te działają krótko i w niskiej temperaturze (poniżej 0 ⁰C), białko nie ulega denaturacji i można je rozpuścić. Wytrącanie w temperaturze pokojowej przy długotrwałym działaniu rozpuszczalników organicznych, prowadzi do denaturacji białka i staje się ono nierozpuszczalne.

Wykonanie:

-Odmierzyć do dwóch probówek po:

• 2 ml etanolu

• i dodać po 0,5 ml roztworu białka jaja kurzego.

-Natychmiast po wytrąceniu osadu:

• do jednej probówki dodać 10 ml wody,

• a drugą probówkę pozostawić na 30 minut. Po tym czasie dodać do niej również 10 ml wody.

Zanotować wynik, porównać efekt w obu probówkach i wyjaśnić przyczyny obserwowanego zjawiska.

Zadanie 5. Wysalanie białek

Białka rozpuszczalne w wodzie można wytrącić z roztworu dużym stężeniem soli. Proces ten nazywamy wysalaniem. Sole wiążące wodę pozbawiają cząsteczki białka płaszcza wodnego, co zmniejsza ich rozpuszczalność i prowadzi do wytrącania z roztworu. Najczęściej do wysalania stosuje się (NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄ lub MgSO₄. Wysalanie jest procesem odwracalnym. Po zmniejszeniu stężenia soli, można ponownie rozpuścić wytrącone białko. Wykazuje ono swoje rodzime właściwości, ponieważ wysalanie nie powoduje denaturacji.

Albuminy można oddzielić od globulin wykorzystując ich różną rozpuszczalność w stężonych roztworach soli. Globuliny tracą wodę hydratacyjną już przy 50% nasyceniu (NH₄)₂SO₄, albuminy wysalają się dopiero po całkowitym nasyceniu roztworu (NH₄)₂SO_4.

• Wykonanie

1. Do probówki odmierzyć 2 ml roztworu białka jaja kurzego i dodać 2 ml

nasyconego roztworu siarczanu amonowego.
Wytrąca się kłaczkowaty osad globulin.

Zaobserwować wynik.

Następnie dodać około 10 ml wody. Osad ulega rozpuszczeniu.

2. Do 50 ml erlenmajerki odmierzyć 10 ml roztworu białka jaja kurzego

i dodać taką samą ilość nasyconego roztworu siarczanu amonowego (10 ml), wymieszać. Wytrąceniu ulegają globuliny.

Próbę przesączyć przez sączek bibułowy do suchej probówki.

Pobrać 2 ml przesączu i dodawać małymi porcjami siarczan amonowy
w substancji do uzyskania nasyconego roztworu aż na dnie probówki pozostanie kilka nierozpuszczonych kryształów siarczanu amonu.
W tych warunkach wypadają wysolone albuminy.

3. Wytrącony osad albumin zebrać na sączku bibułowym (przesączyć próbę), a otrzymany przesącz zbadać w celu stwierdzenia obecności białek. W tym celu do przesaczu należy dodać kroplę 1 % kwasu octowego i wstawić do wrzącej łaźni na parę minut.

Brak osadu świadczy o nieobecności białek w roztworze.

Zadanie 6. Próba Taubera z benzydyną na pentozy - pokaz

Próba Taubera z benzydyną jest charakterystyczna dla pentoz wolnych i związanych

w kwasach nukleinowych. Pentozy wielocukrowców dają reakcję dopiero po hydrolizie.
W obecności lodowatego CH₃COOH furfural powstaje z pentoz dużo łatwiej niż hydroksymetylofurfural z heksoz przez co próba Taubera jest uważana za ujemną dla heksoz, a dodatnia dla pentoz.

• Wykonanie:

Do 1 ml 4 % roztworu benzydyny w lodowatym CH₃COOH wprowadzić po 2-3 krople roztworu pentozy, heksozy i kwasu nukleinowego. Ogrzać do wrzenia (nie za długo) i oziębić, dodać 2 ml wody. Powstaje czerwone zabarwienie w próbach zawierających pentozy. Heksozy dają zabarwienie żółtobrązowe.

---