Metody badania kwasów nukleinowych

PCR:

- umożliwiającej szybką amplifikację w probówce fragmentów

materiału genetycznego

- dzięki wykorzystaniu sond molekularnych, enzymów restrykcyjnych

i takich technik, jak: klonowanie DNA, sekwencjonowanie, znakowanie i detekcja DNA

oraz synteza oligonukleotydów.

Analiza DNA

6.2.1. Zasady pobierania, zabezpieczania i przesyłania materiału do badań

Warunkiem przeprowadzenia analizy DNA jest jego izolacja. Do badań molekularnych jego

źródłem mogą być:

 limfocyty krwi obwodowej,

 hodowle fibroblastów skóry,

 komórki nabłonkowe,

 cebulki włosowe,

 komórki szpiku kostnego,

 fragmenty dowolnej tkanki (guzy nowotworowe, bioptaty, wycinki),

 dowolny materiał biologiczny (surowica, mocz, kał, płyny z jam ciała).

1. W badaniach prenatalnych jako źródło DNA wykorzystuje komórki płynu owodniowego oraz komórki trofoblastu).

2. W badaniach preimplantacyjnych potrzebną ilość DNA z 1 lub 2 blastomerów pobranych z 8-komórkowego zarodka.

3)Krew pobrana w sposób jałowy do probówki z kwasem etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) jako Nie należy używać probówek z heparyną, gdyż hamuje polimerazy DNA. Wycinki tkanek sterylnie pobrane w probówkach wolnych od enzymów degradujących DNA i umieszkone w suchym lodzie, zamrozone.

4)Do izolacji DNA używa się zwykle gotowych zestawów. Otrzymane DNA poddaje się ocenie ilościowej i jakościowej (analiza spektrofotometryczna i rozdział elektroforetyczny). DNA po wysuszeniu lub rozpuszczeniu w wodzie lub odpowiednim buforze (np. Tris-EDTA, TE) przechowywać w temp. 4°C lub zamraża w temp. -80°C.

5)Namnożenie DNA (amplifikacja) - reakcji łańcuchowej polimerazy.

W skład mieszaniny reakcyjnej PCR wchodzą:

 oligonukleotydowe startery,

 termostabilna polimeraza DNA,

 bufor dla polimerazy,

 mieszanina deoksyrybonukleotydotrifosforanów (dATP, dGTP, dTTP, dDTP),

 jony Mg2+,

 matrycowy DNA,

 woda.

W technice PCR w wyniku cyklicznych zmian temperatury następują kolejno:

-denaturacja dwuniciowego DNA

-specyficzne łączenie starterów z matrycą (hybrydyzacja) i ich wydłużanie (elongacja).

(ok. 3640 razy -> 10n-krotne powielenie fragmentu)

- detekcja produktów amplifikacji DNA. Sprawdzenie specyficznosci - czy widoczne w żelu po elektroforezie prążków bp

odmiany technik PCR:

1)Wewnętrzna lub gniazdowa PCR wykorzystuje się startery „zewnętrzne” i ,,wewnętrzne”.

1. PCR z użyciem starterów ,,zewnętrznych”

2. Powstający produkt staje się matrycą w drugiej reakcji polimerazowej,

która wykorzystuje startery ,,wewnętrzne” i amplifikuje krótszy fragment DNA zawierający się wewnątrzsekwencji powielonej w pierwszej PCR. Użycie dwóch par starterów zmniejsza prawdopodobieństwo

powielenia niewłaściwego fragmentu i tym samym zwiększa specyficzność procedury, powodując

równocześnie wzrost czułości reakcji. Technikę wykorzystującą nested PCR stosuje się, gdy

ilość uzyskanego w wyniku izolacji matrycowego DNA jest bardzo mała.

2) Multipleks PCR - jednoczesnej amplifikacji kilku fragmentów DNA o róznej wielkkosci używając kilku par starterów w mieszninie(powoduje jednoczesną amplifikację kilku regionów jednego lub kilku genów). Amplifikowane fragmenty

mają różnić się wielkością, aby łatwo je rozróżnić po rozdziale elektroforetycznym.

Metoda multipleks PCR wykorzystana w dystrofii mięśniowej Duchenne'a. wykrycie blisko 100% dużych delecji w genie DMD. Produkty poddawane analizie np. w kierunku wykrywania mutacji punktowych lub polimorfizmów.

Celem jest sama tylko detekcja badanego genu (np. znalezienie fragmentu genomu czynnika zakaźnego w celu potwierdzenia zakażenia), wystarczająca

jest wówczas analiza produktu amplifikacji uwidocznionego po rozdziale w żelu. W in6.

Zastosowanie metod biologii molekularnej (…) 55

nych przypadkach, w powielonym fragmencie badanego genu poszukuje się mutacji odpowiedzialnej

za wystąpienie choroby (diagnostyka chorób uwarunkowanych genetycznie  w tym również diagnostyka

prenatalna i onkologiczna).

Najbardziej bezpośrednim podejściem do wykrywania mutacji jest określenie sekwencji nukleotydów

składających się na zapis informacji w DNA, czyli sekwencjonowanie. Metoda ta nie jest

jednak wykonywana rutynowo, gdyż jest zbyt kosztowna. Z tego powodu sekwencjonowanie poprzedza

się jedną z technik służących do przesiewowego wykrywania mutacji i dopiero po wstępnym wyselekcjonowaniu

zmienionych fragmentów DNA poddaje się je sekwencjonowaniu.

Do najczęściej wykorzystywanych metod przesiewowych należą:

Badanie polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów DNA (SSCP - single

strand conformation polymorphism). Materiałem wyjściowym do analizy SSCP są produkty PCR,

które poddaje się denaturacji chemicznej pod wpływem formamidu, rzadziej mocznika lub wodorotlenku

sodu. Następnie tak przygotowane produkty PCR rozdziela się w niedenaturującym żelu poliakrylamidowym.

W warunkach natywnej elektroforezy jednoniciowe cząsteczki DNA ulegają wewnętrznemu

parowaniu zasad, przez co przyjmują określoną konformację przestrzenną zależną od

sekwencji nukleotydów. Fragmenty o takiej samej długości i sekwencji nukleotydów przyjmują takie

same konformacje i wykazują taką samą ruchliwość elektroforetyczną. Fragment z mutacją utworzy

odmienny od prawidłowego wzór prążków SSCP, ponieważ tworzy inne „konformery” migrujące ze

zmienioną szybkością. Teoretycznie zmiana jednego nukleotydu skutkuje zmianą szybkości migracji

w żelu. W praktyce jednak technika ta nie wykrywa wszystkich zmian sekwencji. Największą, bo ponad

95% wykrywalność, osiąga się dla fragmentów DNA o wielkości 100300 pz. Dla fragmentów

300450 pz wykrywalność spada poniżej 80%. Dłuższe produkty PCR można przed analizą SSCP

strawić odpowiednio dobranym enzymem restrykcyjnym tak, by uzyskać fragmenty o optymalnej

wielkości.

Elektroforeza w gradiencie czynnika denaturującego (DGGE - denaturating gradient gel

electrophoresis) i w gradiencie temperatury (TGGE - temperature gradient gel electrophoresis) to

metody służące do wykrywania pojedynczych mutacji w materiale genetycznym oparte na podatności

DNA na denaturację pod wpływem substancji denaturujących lub temperatury. Wykorzystuje się tutaj

elektroforezę poliakrylamidową z rosnącym stężeniem mocznika w żelu w metodzie DGGE oraz gradient

temperatury w TGGE. Cząsteczki DNA o różnej sekwencji, a tym samym różnej temperaturze

topnienia, migrując w żelu o rosnącym stężeniu związku denaturującego (lub w gradiencie temperatury)

pokonują różną drogę. Ze względu na różnice w sekwencji badanych fragmentów DNA uzyskuje

się w żelu układ prążków, z których każdy odpowiada konkretnemu fragmentowi namnożonego DNA.

Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP - restriction fragments

length polymorphism). Jest to technika polegająca na analizie różnicy w długości fragmentów DNA

powstałych na skutek oddziaływania enzymu restrykcyjnego na badany fragment genu. Analizowany

fragment DNA przecinany jest przez enzym restrykcyjny z grupy endonukleaz w określonych miejscach

o charakterystycznej sekwencji nukleotydów - tzw. miejscach restrykcyjnych, precyzyjnie rozpoznawanych

przez dany enzym. W zależności od liczby miejsc restrykcyjnych w DNA i odległości

między nimi, po analizie restrykcyjnej otrzymuje się określoną liczbę fragmentów restrykcyjnych

o odpowiedniej długości (tzw. wzór restrykcyjny). RFLP pozwala zarówno na analizę polimorfizmu

badanego DNA, jak i na wykrycie mutacji. W przypadku mutacji dotyczącej miejsca restrykcyjnego,

zmiana w sekwencji DNA może spowodować zanik miejsca restrykcyjnego (brak cięcia - mniej fragmentów

restrykcyjnych). W wyniku mutacji może również dojść do powstania dodatkowego miejsca

restrykcyjnego i zwiększenia liczby fragmentów po cięciu. Zmianę liczby i lokalizacji miejsc restrykcyjnych

można zaobserwować w postaci zmienionej liczby fragmentów DNA powstałych po analizie

restrykcyjnej. Gdy mutacja nie dotyczy miejsca restrykcyjnego i ma charakter większej (powyżej

50 pz) insercji lub delecji, można ją wyodrębnić na podstawie zmienionej długości fragmentu, w ramach

którego miała miejsce. Długość fragmentów DNA otrzymanych po działaniu enzymu restrykcyjnego

na cząsteczkę DNA określa się na podstawie rozdziału elektroforetycznego w żelach agarozowych

w obecności markerów wielkości.

6.3. Analiza RNA

RNA (nietrwały), chroniony przed rybonukleazami poprzez stosowanie

odczynników, pipet i ich nasad z filtrem, sterylnego sprzętu jednorazowego

użytku i ogolna czystość - do izolacji RNA.

Do izolacji RNA można wykorzystać następujący materiał:

 krew obwodową,

 szpik,

 tkanki (wycinki, bioptaty, fragmenty guzów nowotworowych),

 komórki jednojądrzaste krwi obwodowej/szpiku,

 komórki z hodowli założonej do badań cytogenetycznych utrwalone mieszaniną kwasu octowego

i metanolu.

Do uzyskania 36 μg RNA potrzeba:

- co najmniej 12 x 107 komórek

• 10-20 ml krwi obwodowej (dostarczone w 24h do lab. 4 stopnie C)

• 25 ml szpiku kostnego (-=-)

pobranych do probówek z EDTA lub cytrynianem sodu.

Tkanki umieścić w jałowym pojemniku i do suchego lodu lub RNAlater (stabilizuje RNA i trzymanie w niskiej temp). Izolację RNA z krwi i szpiku należy poprzedzać lizą

erytrocytów lub separacją komórek jednojądrzastych metodą wirowania w gradiencie gęstości.

Podstawową metodą izolacji RNA:

- metoda opisana przez Chomczyńskiego i Sacchi w 1987 roku (z modyfikacją używając trizolu)

- metoda kolumienkowa wykorzystująca właściwości

soli chaotropowych i złóż krzemionkowych, (prosta i chroni RNA przed degragacją). Po izolacji należy ocenić stężenie i czystość RNA na podstawie pomiaru absorbancji(-> ujednolicenie ilości RNA używanego do reakcji odwrotnej transkrypcji)

roztworu RNA w świetle UV. Potem przechowywać w buforze w -80C(brak namnażania i zamrażania).Zamiast RNA można przechowywać cDNA, uzyskany

w procesie odwrotnej transkrypcji(mniej degradowalny) Podobnie jak DNA, cDNA

może być przechowywany po wysuszeniu w buforach do elucji z kolumienek lub w buforze TE.

Zamrożenie cDNA w temp. -80ºC.

Odwrotna transkrypcja - polega na uzyskaniu nici DNA komplementarnej do RNA (cDNA) z użyciem odwrotnej transkryptazy. Potem cDNA to matryca do PCR.(w jednej probówce przy użyciu specyficznych starterów).

jednostopniowej reakcji RT - większą powtarzalność wyników i mniejsze ryzyko kontaminacji(bo mniej etapów). Uzyskany tak cDNA jest wykorzystany tylko do jednego testu genetycznego, bo startery GSP pozwalają na selektywne przepisanie

mRNA badanego genu na cDNA, dlatego też do syntezy cDNA wykorzystuje się również inne

typy starterów: oligo(dT) oraz krótkie i niespecyficzne startery losowe (heksamery, oktamery, nonamery) w zależności od przeznaczenia uzyskanego cDNA. Tylko losowe heksamery umożliwiają przepisanie na cDNA wszystkich sekwencji RNA, co jest niezbędne w niektórych aplikacjach, np. w

lizie ekspresji genów za pomocą mikromacierzy oligonukleotydowych. Startery oligo(dT) natomiast

hybrydyzują do fragmentu poli(A) mRNA i pozwalają otrzymać cDNA o długości do 5 kb.

W przypadku aplikacji bardzo czułych na niewielkie nawet ilości genomowego DNA (np. ilościowa

reakcja polimerazy w czasie rzeczywistym dla genów o niskiej ekspresji) niezbędne jest usunięcie

genomowego DNA za pomocą DNazy bezpośrednio po izolacji RNA lub przed wykonaniem

odwrotnej transkrypcji.

Uzyskane cDNA może być wykorzystane jako matryca w jakościowej reakcji łańcuchowej polimerazy

w celu ujawnienia transkryptu badanego genu lub w ilościowej łańcuchowej reakcji polimerazy

w czasie rzeczywistym (RT-Q-PCR - real-time quantitative polymerase chain reaction) wykorzystywanej

do oceny względnej i bezwzględnej ilości matrycy oraz określenia poziomu ekspresji

genu (ilościowa analiza ekspresji genu). Reakcja PCR w czasie rzeczywistym polega na amplifikacji

DNA i monitorowaniu jego ilości w każdym kolejnym cyklu reakcji. Jest to możliwe dzięki obecności

w mieszaninie reakcyjnej odpowiednich barwników lub sond znakowanych fluorescencyjnie. Emitowany

sygnał fluorescencyjny jest proporcjonalny do liczby powstających cząsteczek DNA.

W zależności od użytych barwników i sond w reakcji RT-Q-PCR można wykrywać sekwencje

niespecyficzne (stosując np. barwnik SYBR Green) lub specyficzne  gdy w mieszaninie reakcyjnej

startery lub sonda wyznakowane są fluorescencyjnie. Podczas reakcji dochodzi wtedy do przeniesienia

energii zaabsorbowanej przez jeden fluorochrom (reporter) na drugi, który emituje światło o innej

długości lub dochodzi do wygaszenia emisji fluorochromu przez związek wygaszający. Detekcja niespecyficzna

to najprostsza i najmniej kosztowna metoda, jednak najbardziej podatna na błędy, np.

wskutek wiązania się fluorochromu ze strukturą primer-dimer, powstającą w wyniku wiązania

się starterów ze sobą, gdy są one częściowo do siebie komplementarne, czy z innymi niespecyficznymi

produktami reakcji. Zdecydowanie lepsze wyniki uzyskuje się po zastosowaniu detekcji specyficznej,

np. z użyciem sond typu TaqMan®.

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-Q-PCR - real-time

quantitative polymerase chain reaction) wykonana w technologii TaqMan®.

Metoda ta jest oparta na pomiarze zmian fluorescencji w czasie rzeczywistym, w kolejnych cyklach

reakcji PCR. Jest to możliwe dzięki dodaniu do reakcji specjalnie znakowanej sondy molekularnej

TaqMan® komplementarnej do fragmentu DNA zlokalizowanego pomiędzy starterami. Sonda

składa się z kilkunastu nukleotydów, do których przy końcu 5' przyłączony jest kowalencyjnie fluorescencyjny

barwnik reporterowy (R), natomiast przy końcu 3' znajduje się tzw. wygaszacz (W). Kiedy

sonda jest nienaruszona, bliskość wygaszacza tłumi fluorescencję barwnika reporterowego. Podczas

wydłużania łańcucha DNA polimeraza o aktywności 5'-3'-nukleazy powoduje degradację zhybrydyzowanej

z matrycą sondy i przestrzenne rozdzielenie barwnika reporterowego oraz wygaszacza, czego

skutkiem jest wzrost fluorescencji rejestrowany przez odpowiedni detektor. Intensywność fluorescencji

stanowi ilościowy wykładnik powstającego produktu PCR i jest proporcjonalna do początkowej

ilości matrycy w analizowanym materiale. Fragmenty zdegradowanej sondy są odłączane od matrycy,

a synteza komplementarnej nici jest kontynuowana (ryc. 1). Aby zapobiec wydłużaniu sondy w czasie

reakcji PCR - koniec 3' sondy jest odpowiednio zablokowany. Użycie specyficznych starterów i sond

daje pewność, że amplifikowana jest wyłącznie pożądana sekwencja. Umożliwia to specyficzną detekcję

i analizę ilościową amplifikowanego produktu.

Real-time PCR pozwala obliczyć liczbę kopii badanego fragmentu DNA, jaka była obecna

w mieszaninie przed reakcją. Do tego celu wykorzystuje się moment, w którym intensywność fluorescencji

użytego barwnika przekroczyła tzw. wartość Ct (threshold cycle), definiowaną jako numer

cyklu, w którym dochodzi do przyrostu fluorescencji ponad tzw. linię odcięcia. Im wcześniej fluorescencja

wzrośnie do określonego poziomu, tym więcej było kopii badanej sekwencji w próbce na początku

reakcji. Najczęściej Ct jest momentem wejścia reakcji w fazę logarytmicznego przyrostu ilości

produktu (ryc. 2). W celu zbadania liczby kopii badanej sekwencji w próbie, sporządza się serię rozcieńczeń

roztworu o znanym stężeniu i liczbie kopii DNA, wykreśla się krzywą standardową i dla

danego punktu Ct, na podstawie uzyskanej krzywej standardowej, szacuje się wyjściową liczbę cząsteczek DNA w próbce.

2. TECHNIKI MOLEKULARNE WYKORZYSTYWANE

W ANALIZIE MUTACJI I POLIMORFIZMÓW

1)analiza restrykcyjna - pozwala nawstępną analizę populacji pod kątem obecności ważnej mutacji - poprzedzona amplifikacją fragmentu genu PCR.

2)Do zastosowania tej metody PCR-RFLP niezbędna jest znajomość sekwencji genu i zaprojektowanie na tej podstawie odpowiednich starterów oligonukleotydowych potrzebnych do reakcji PCR. Sam fragment genu ze zmianą musi być znany, żeby dopasować enzym restrykcyjny.

- stosowana do potwierdzenia znanej mutacji w odniesieniu do badanej populacji.

3)RFLP stosowana do całości genomowego DNA (trawienia

restrykcyjnego nie poprzedza się amplifikacją fragmentu genu na drodze PCR). Daje więcej informacji niż PCR-RFLP. wymaga zastosowania

sond molekularnych do badanego genu.

W RFLP wykorzystuje się technikę Southern blotingu.

SSCP - Polimorfizm Konformacji Jednoniciowych Fragmentów DNA

Wykrywanie polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów DNA opiera się na różnicach w konformacji łańcucha DNA i odmiennych sekwencji nukleotydów w poszczególnych niciach DNA, spowodowanych obecnością mutacji. Szybkość migracji fragmentów DNA w niedenaturującym żelu poliakrylamidowym

zależy od masy cząsteczkowej DNA.

W przypadku kwasów nukleinowych(molekuła liniowa), masa cząsteczkowa wzrasta proporcjonalnie do długości łańcucha. Szybkość wędrówkiod jego długości - dla dwuniciowych cząsteczek DNA (dsDNA). Dla pojedynczych nici DNA (ssDNA), długość i konformacja przestrzenna są wazne.

Ta właściwość została wykorzystana w technice SSCP. zmiana pojedynczego nukleotydu zmienia konformację przestrzenną cząsteczki (możliwe odróżnienie obu wariantów w żelu poliakrylamidowym)

a)W przypadku osobnika homozygotycznego pod względem badanego odcinka DNA na żelu (tzw. Typ dziki) powinny powstać dwa prążki, po jednym dla każdej z nici DNA b)Analogiczny wynik dwóch prążków uzyska się dla homozygotycznego mutanta, tj.

takiego, gdzie identyczna mutacja powstała w obu niciach DNA - tu dwa prążki odpowiadające jednoniciowym fragmentom DNA będą ułożone inaczej, niż dla „typu dzikiego”.

c)Trzecia możliwość - osobnik heterozygotyczny - będzie posiadał aż cztery prążki na żelu, których ułożenie będzie takie, jak u formy dzikiej i formy zmutowanej.

Analizując SSCP, należy równolegle do

próbek badanych rozdzielić na żelu dwuniciowy produkt PCR, tj. niepoddany denaturacji

termicznej. Jest to bardzo istotne, ponieważ na ogół nie da się poddać

denaturacji wszystkich dwuniciowych fragmentów i wciąż pozostają one widoczne na

żelu wśród produktów jednoniciowych.

Elektroforeza SSCP

Schemat działania

1. Przeprowadzić reakcję PCR dla badanego fragmentu DNA.

2. Przygotować żel poliakrylamidowy (20 ml):

a. 40% akrylamid 5 ml

b. Bufor TBE 10 x 2 ml

c. nadsiarczan amonu 10% 130 μl

d. TEMED 16 μl

e. glicerol 100% 1 ml

f. woda dejonizowana do 20 ml

3. Zmieszać 6-30 μl mieszaniny PCR z odpowiednią objętością wybranego buforu obciążającego.

4. Denaturacja 85°C/10 minut.

5. Inkubacja na lodzie/5 minut.

6. Nałożyć próbki na żel.

7. Prowadzić elektroforezę przy napięciu 10-30 V/cm, w stałej temperaturze, 1,5-3 godz.

8. Po elektroforezie barwić żel w roztworze bromku etydyny (0,5 μg/ml) 10-40 minut.

9. Odpłukać nadmiar bromku, wyniki analizować w świetle UV254.

Bufor obciążający do SSCP: dejonizowany 95% formamid + błękit bromofenolowy 0,5% + cyjanol

ksylenu 0,5% [2]

Uwaga! SSCP była skuteczna - maks długosc fragmentu 400 nukleotydów. Przed rozdziałem w żelu, badany fragment DNA jest powielany PCRem. Główną zaletą SSCP nie jest konieczna wcześniejsza znajomość badanej sekwencji. Ważne jest jedynie zaprojektowanie odpowiednich starterów

do PCR, by produkt nie przekraczał 400 par zasad(jeśli dłuższe stosujemy trawienie restrykcyjne).

Opcjonalnie, jeżeli analizowany fragment posiada zupełnie nieznaną sekwencję nukleotydową, można go powielić poprzez wklonowanie do odpowiedniego wektora, a następnie użyć do PCR tzw. „starterów uniwersalnych (T3, T7, M13).

Powielony fragment rozdziela w żelu poliakrylamidowym o właściwościach niedenaturujących.

Niestety, nie można ustalić uniwersalnych warunków prowadzenia elektroforezy, szczegóły należy dopracować metodą prób i błędów dla konkretnego, analizowanego fragmentu genu. Zazwyczaj sprawdza się jeden z poniższych sposobów:

• 6% żel poliakrylamidowy, 5% glicerol, 1x bufor TBE1, 18°C

• 6% żel poliakrylamidowy, 1x bufor TBE , 4°C

Rozdział elektroforetyczny należy prowadzić w żelu o wymiarach ok. 15 x 15 cm. Przykładowym aparatem do elektroforezy, jaki można zastosować w technice SSCP, jest Protean II.

Barwienie srebrowe

Po elektroforezie żel odkleić ostrożnie od szyb. Przenieść do wanienki. Przeprowadzić

następujące płukania (mieszając na kołysce laboratoryjnej):

1. 20% kwas trichlorooctowy (TCA) 5 min

2. 5% glutaraldehyd lub 2% formaldehyd 6 min

3. Woda destylowana 2 x 2 min

4. 0,4% AgNO3 10 min

5. Woda destylowana 2,5 min

6. Woda destylowana 0,5 min

7. Woda destylowana 0,5 min

8. Przygotować roztwór wywołujący (na świeżo): Na2CO3 2,5%, formaldehyd 0.01%

9. Wywołanie 2-3 porcjami, do pojawienia się prążków

10. Kwas octowy 5% 7 min

11. Kwas octowy 10%, glicerol 10% 10 min

systemu chłodzącego, lub lodówka 4° C - umożliwia to podłączenie kriostatu lub innego źródła wody chłodzącej.

Ważne - utrzymywanie stałej temperatury żelu(inaczej spadek skutecznosci wykrywania mutacji i brak badania próbek miedzy sobą).

Po rozdziale elektroforetycznym jednoniciowych fragmentów DNA obraz na żelu

należy uwidocznić za pomocą bromku etydyny (EtBr) o stężeniu

0,25-0,5 μg/ml, potem 10 moczenia zelu w nim i potem płukanie wodą.

Uwaga! Bromek etydyny wykazuje silne właściwości kancerogenne!

Alternatywą dla EtBr jest roztwór odczynnika interkalującego DNA SYBR-Green I

który zakupuje stężony i rozcieńcza bezpośrednio

przed użyciem. SYBR-Green I bezpieczniejsze, choc tez wchodzi w interakcje.

Żel można także barwić tzw. techniką srebrzenia za pomocą azotanu srebra. Metoda pracochłonna, wymaga kilku etapów

barwienia/płukania. Zaletą niższa toksyczność i trwałość wybarwionych fragmentów. Żele barwione techniką srebrową i odpowiednio wysuszone można bardzo długo przechowywać.

technika SSCP ma ograniczenia w wykrywaniu mutacji. Wystąpienie mutacji

może, choć nie musi, wpływać na zmianę konformacji przestrzennej nici DNA na tyle,

aby różnica była zawsze widoczna po rozdziale elektroforetycznym. Dlatego brak różnic

pomiędzy próbkami w obrazie prążków na żelu nie upoważnia do stwierdzenia, że mutacja

na pewno nie miała miejsca. W przypadkach wątpliwych należy potwierdzić obecność

lub brak mutacji, stosując technikę sekwencjonowania.

Mutacje, które nie zostają uwidocznione za pomocą opisywanej techniki SSCP,

można często wykryć metodą TGGE (ang. temperature gradient gel electrophoresis). Przebieg

analizy jest zasadniczo podobny, jak w przypadku SSCP, jednak temperatura żelu jest ściśle

kontrolowana i rozłożona gradientowo na całej jego szerokości. Wówczas prawdopodobieństwo

odnalezienia mutacji znacznie rośnie, ponieważ ewentualne różnice w konformacji

jednoniciowych fragmentów DNA mogą uwidaczniać się tylko w określonej

temperaturze. Wadą tej metody jest konieczność posiadania specjalnego urządzenia do

wytwarzania gradientu temperatury.

Jeszcze inną modyfikacją metody SSCP jest DGGE (ang. denaturing gradient gel electrophoresis).

W tym przypadku czynnikiem różnicującym (wpływającym na powstawanie

różnych konformacji przestrzennych) jest wzrastające stężenie związku denaturującego -

najczęściej mocznika.

---