SPEKTROFOTOMETRIA.

1. Prawa absorpcji.

I prawo absorpcji (prawo Bouguera-Lamberta). Wiązka światła monochromatycznego po przejściu przez jednorodny ośrodek absorbujący o grubości d ulega osłabieniu według równania:

gdzie: I₀ - natężenie wiązki promieniowania monochromatycznego padającego na jednorodny ośrodek absorbujący; I - natężenie promieniowania po przejściu przez ośrodek absorbujący, k - współczynnik absorpcji, charakterystyczny dla danej substancji. Zależność tę wygodniej jest przedstawić w formie logarytmicznej:

A = ln
= kd

lub

A = log
= ad

gdzie: a = 0,4343k, A - zdolność pochłaniania, zwana absorbancją. Obok terminu absorbancja używane są także inne terminy, tj.: wartość absorpcji, ekstynkcja (E) lub gęstość optyczna (D).

I prawo absorpcji można także sformułować w następujący sposób: absorbancja jest proporcjonalna do grubości warstwy absorbującej, jeżeli wiązka promieniowania monochromatycznego przechodzi przez jednorodny ośrodek absorbujący.

Często przy określaniu ilości zaabsorbowanego promieniowania spotykamy się z wielkością nazywaną transmitancją (T), zdefiniowaną jako:

T =

A zatem:

A = log

Transmitancja podawana jest najczęściej w procentach; w związku z tym:

%T =
100 = 100 T

II prawo absorpcji (prawo Beera). Prawo to dotyczy absorpcji promieniowania elektromagnetycznego przez roztwory i można je sformułować w następujący sposób: jeżeli współczynnik absorpcji rozpuszczalnika jest równy zeru, to wiązka promieniowania monochromatycznego, po przejściu przez jednorodny roztwór substancji absorbującej o stężeniu c, ulega osłabieniu według równania:

W formie logarytmicznej zależność ta może ma postać:

A = ln
= kdc

lub

A = log
= adc

Prawo to można sformułować w ten sposób: jeżeli współczynnik absorpcji rozpuszczalnika jest równy zeru, to absorbancja wiązki promieniowania monochromatycznego przechodzącego przez roztwór jednorodny jest wprost proporcjonalna do stężenia roztworu c i do grubości warstwy absorbującej d.

III prawo absorpcji (prawo addytywności absorpcji). Absorbancja roztworu wieloskładnikowego równa się sumie absorbancji poszczególnych składników:

A = A₁ + A₂ + ... + A_n

A₁, A₂, ... , A_n są to absorbancje poszczególnych składników.

Prawo addytywności umożliwia analizę ilościową układów wieloskładnikowych.

W równaniu na absorpcję:

A = acd

wielkość a jest właściwym współczynnikiem absorpcji, gdy stężenie wyrażamy w g/cm³. natomiast, gdy stężenie wyrażamy w mol/dm³, to równanie to przybiera postać:

A = εcd

Współczynnik ε nazywamy molowym współczynnikiem absorpcji. Współczynnik ten nie zależy od stężenia, a zatem na wykresie zależności ε = f (c) otrzymamy linię prostą, równoległą do osi odciętych. Współczynnik ten zależy natomiast od długości fali światła padającego, rodzaju substancji absorbującej światło i temperatury roztworu.

Wartość A zależy od stężenia roztworu, a funkcja A = f (c) jest linią prostą, jeżeli roztwór spełnia prawo Beera.

Absorbancja zależy także od długości fali λ światła padającego. Wykres zależności absorbancji od długości fali określa się mianem krzywej absorpcji lub elektronowym widmem absorpcyjnym.

2. Odchylenia od praw absorpcji.

Odchylenia od praw absorpcji mogą być związane z podstawowymi ograniczeniami praw lub też z czynnikami chemicznymi bądź aparaturowymi.

Prawa absorpcji spełnione są dla roztworów rozcieńczonych (c < 10^-2 mol/dm³). W roztworach takich nie występuje zależność molowego współczynnika absorpcji od współczynnika załamania światła. W przypadku roztworów stężonych ε jest funkcją rzeczywistego molowego współczynnika absorpcji ε_rz i współczynnika załamania światła n zgodnie z równaniem:

Prawa absorpcji zakładają, że jedynym oddziaływaniem promieniowania elektromagnetycznego z substancją rozpuszczoną jest absorpcja promieniowania w myśl schematów:

X + hν
X*

X*
X + ciepło

Jednakże degradacja wzbudzonej cząsteczki (X*) do stanu podstawowego (X) jest możliwa również na drodze fluorescencji lub fosforescencji w myśl schematu:

X*
X + ciepło + hν'

gdzie ν' - częstotliwość promieniowania na drodze fluorescencji lub fosforescencji. W takim przypadku pozorna transmitancja będzie podwyższona, a zatem pozorna absorbancja będzie niższa od rzeczywistej.

Czynniki chemiczne powodujące odchylenia od praw absorpcji są związane z reakcjami chemicznymi zachodzącymi w analizowanym roztworze. Przy zmianie pH roztworu i zmianie jego stężenia mogą zachodzić takie reakcje, jak: dysocjacja, asocjacja, różne reakcje kompleksowania, polimeryzacja i solwatacja. Zmiany właściwości optycznych analizowanych substancji, związane z tymi reakcjami, tłumaczą następujące przykłady:

1. Alkohol benzylowy w roztworze CCl4 w zależności od stężenia może występować w formie monomeru lub polimeru:

n C₆H₅CH₂OH (C₆H₅CH₂OH)_n

(λ_max = 270 nm) (λ_max = 300 nm)

Stąd, w zależności od długości fali, przy której będzie wykreślana krzywa wzorcowa, mogą nastąpić dodatnie lub ujemne odchylenia od prawa absorpcji.

2. W roztworach kwasów i zasad mogą, w zależności od pH, ustalać się różne równowagi kwasowo-zasadowe. Na przykład kwas benzoesowy w formie niezdysocjowanej i w formie zdysocjowanej charakteryzuje się różnymi wartościami λ_max i ε:

C₆H₅COOH + H₂O C₆H₅COO⁻ + H₃O⁺

(λ_max = 273 nm, ε = 970) (λ_max = 268 nm, ε = 560)

Dla takiego układu prawo absorpcji jest spełnione tylko w ściśle określonym pH roztworu i przy stałej sile jonowej.

3. W roztworze dwuchromianu potasowego, w miarę jego rozcieńczani, pomarańczowy K₂Cr₂O₇ przechodzi w żółty K₂CrO₄ w myśl równania:

Cr₂O₇²⁻ + H₂O 2 CrO₄²⁻ + 2 H⁺

W zależności od długości fali, przy której mierzona jest absorbancja, może wystąpić dodatnie lub ujemne odchylenie od praw absorpcji. Równowaga tej reakcji może być kontrolowana poprzez buforowanie dwuchromianu silnym kwasem lub chromianu silną zasadą.

4. W przypadku tworzenia kompleksów równowagi reakcji uzależnione są od stężenia ligandów. Wymagane jest stałe stężenie i to takie, które znacznie przekracza stężenie oznaczanego metalu. Na przykład układ Fe (III) - SCN⁻ lub Cu (II) - NH₃, w którym zachodzi stopniowe tworzenie się kompleksów, nie spełnia na ogół prawa absorpcji.

5. Oddziaływanie rozpuszczalnika z badaną substancją powoduje często zmianę położenia λ_max, zmienia kształt pasma, a także wpływa na wartość ε. Rozpuszczanie substancji powoduje najczęściej przesunięcie pasma absorpcyjnego w kierunku fal dłuższych w odniesieniu do pasma w fazie gazowej. Jest to tzw. przesunięcie czerwone lub efekt batochromowy. Efekt ten wzrasta ze wzrostem względnej przenikalności elektrycznej rozpuszczalnika. Wymienione wyżej czynniki mogą powodować dodatnie lub ujemne odchylenia od praw absorpcji.

Czynniki aparaturowe powodujące odchylenie od praw absorpcji są najczęściej związane z brakiem monochromatyczności promieniowania oraz występowaniem promieniowania rozproszonego. Brak monochromatyczności promieniowania stanowi główną przyczynę odchyleń od praw absorpcji. Polichromatyczność promieniowania jest bowiem pogwałceniem założeń praw absorpcji. Niedostateczna monochromatyczność występuje w przypadku pomiarów przy użyciu kolorymetrów i fotokolorymetrów, w których czynnikami monochromatyzującymi są filtry barwne i interferencyjne.

Niekorzystnym zjawiskiem jest występowanie w przyrządach niższej klasy tzw. promieniowania rozproszonego. Jest to takie promieniowanie, które dociera do detektora, a nie przechodzi przez próbkę. Promieniowanie to powoduje wystąpienie ujemnego odchylenia od praw absorpcji.

3. Aparatura.

Dział metod analitycznych opartych na absorpcji promieniowania elektromagnetycznego w zakresie nadfioletu i części widzialnej widma, przyjęto nazywać spektrofotometrią absorpcyjną, a przyrządy absorpcjometrami. W zależności od budowy absorpcjometry można podzielić na 3 grupy: 1) absorpcjometry wizualne - kolorymetry, 2) absorpcjometry fotoelektryczne - fotokolorymetry, 3) spektrofotometry.

Metody, stosujące odpowiednie przyrządy, przyjęto określać mianem kolorymetrii, fotokolorymetrii i spektrofotometrii. Poszczególne grupy przyrządów różnią się szczegółami budowy, jednak wszystkie mają takie same zasadnicze elementy, a schemat blokowy typowych absorpcjometrów składa się z 6 podstawowych układów:

1. Źródło promieniowania: w kolorymetrach - światła lub żarówka; w fotokolorymetrach - lampa wolframowa, lampa rtęciowa; w spektrofotometrach - lampa wolframowa na zakres widzialny i bliską podczerwień. Emituje ona promieniowanie ciągłe w zakresie od 380 do 2500 nm. W zakresie nadfioletu, od 180 do 380 nm, źródłem promieniowania ciągłego są lampy deuterowe lub wodorowe. Źródłem światłą dla zakresu widzialnego i nadfioletu jest wysokociśnieniowa łukowa lampa ksenonowa.

2. Regulacja natężenia promieniowania: przesłona irysowa, szczelina regulowana, opór zmienny w obwodzie lampy. Szerokość szczeliny, w większości przyrządów, zmienia się od 0,01 do 1 mm. Od szerokości szczeliny zależy czułość i rozdzielczość przyrządów. Ogólnie biorąc, rozdzielczość jest tym większa, im węższa jest szczelina.

3. Regulacja długości fali światła padającego: filtry barwne i interferencyjne w kolorymetrach oraz monochromatory (pryzmaty i siatki dyfrakcyjne) w spektrofotometrach. W zakresie widzialnym znajdują zastosowanie filtry wykonane ze szkła barwnego. W zakresie nadfioletu stosuje się filtry krystaliczne z odpowiednich soli lub roztworów soli w naczyniach kwarcowych.

Monochromatory mają zastosowanie w spektrofotometrach i są głównym czynnikiem odróżniającym tę klasę przyrządów od pozostałych absorpcjometrów. Są nimi siatki dyfrakcyjne i pryzmaty. Pryzmaty mają różną budowę. Spotyka się zarówno proste pryzmaty, jak i skomplikowane układy pryzmatyczne. Do najczęściej stosowanych należą:

1. pryzmat Cornu: wykonany z dwóch sklejonych kryształów kwarcu lewo- i prawoskrętnego o sumarycznym kącie łamiącym 60^o. Jest to pryzmat o średniej dyspersji, stosowany w przyrządach niższej klasy.

2. Pryzmat typu Littrowa: wykonany z kwarcu o kącie łamiącym 30^o; ścianka prostopadła do osi optycznej pokryta jest metalem dającym lustro, dzięki temu promień przechodząc przez pryzmat ulega dwukrotnie załamaniu. Pryzmat typu Littrowa stosowany jest do budowy monochromatorów o dużej dyspersji.

3. Pryzmat typu Wadswortha: połączony ze zwierciadłem, najczęściej stosowany w spektrofotometrach na podczerwień.

Siatki dyfrakcyjne stosowane są jako monochromatory, najczęściej w przypadkach, gdy wymagana jest większa dyspersja w zakresie fal długich. Dyspersja siatek dyfrakcyjnych nie zależy od długości fali promieniowania, a tylko od rodzaju siatki dyfrakcyjnej. Ujemną cechą siatek dyfrakcyjnych jest występowanie w widmie promieniowania rozproszonego i to jest główną przyczyną stosowania w spektrofotometrach monochromatorów pryzmatycznych.

4. Pomieszczenie dla substancji badanej: kiuweta, probówka. W zakresie widzialnym stosowane są kiuwety ze szkła lub mas plastycznych. W zakresie nadfioletu stosuje się kiuwety kwarcowe. Kiuwet kwarcowych można używać zarówno w zakresie widzialnym, jak i w nadfiolecie. Grubość kiuwety wynosi zazwyczaj 1 cm, ale można używać zarówno kiuwet o większej, jak i mniejszej grubości.

5. Detektor: w kolorymetrach - oko ludzkie, w fotokolorymetrach - fotoogniwa, fotokomórki, fotopowielacze;

• Fotoogniwa, zwane ogniwami zaporowymi, zbudowane są z trzech warstw. Na płytce z Fe lub Cu znajduje się warstwa półprzewodnika (Se lub CuO), a na niej cienka warstwa metalu: Ag, Pb lub Au. Wiązka światła, padając na Se, wytwarza fotoprąd, który można zmierzyć za pomocą galwanometru, włączonego szeregowo w obwód. Natężenie prądu płynącego w fotoogniwach selenowych jest stosunkowo duże i wynosi około 120 mA na lumen, stąd też fotoogniwa nie wymagają stosowania dodatkowych wzmacniaczy prądu. Fotoogniwo selenowe jest czułe na światło o długości fali 300 - 800 nm.

• Fotokomórki stosowane są najczęściej w spektrofotometrach w połączeniu z odpowiednim układem wzmacniającym. Rozróżnia się fotokomórki próżniowe i fotokomórki wypełnione gazem szlachetnym. W obu przypadkach są to bańki szklane, w których znajduje się katoda w formie blaszki, pokryta warstewką światłoczułą, i anoda w postaci obrączki lub spirali metalowej. Katoda połączona jest z biegunem ujemnym prądu, a anoda z dodatnim. W przypadku, gdy na katodę pada promieniowanie elektromagnetyczne, następuje emisja elektronów, które przyciągane są przez anodę na skutek różnicy potencjałów. Natężenie prądu fotoelektrycznego rejestruje włączony w obwód galwanometr. Natężenie powstającego fotoprądu zależy od natężenia promieniowania padającego na fotokomórkę, od długości fali λ światłą padającego, a także od różnicy potencjałów między elektrodami fotokomórki. Materiałem światłoczułym, pokrywającym katodę, są niektóre metale i tlenki metali.

• Fotopowielacz (fotomnożnik) jest wzmacniaczem bardzo słabych impulsów prądowych, wywołanych działaniem promieniowania elektromagnetycznego o niewielkim natężeniu. Jest to typ lampy elektrodowej zamkniętej z jednej strony fotokatodą, a z drugiej cokołem. Między fotokatodą a anodą znajduje się kilka lub kilkanaście elektrod, zwanych dynodami, do których przyłożone są zmniejszające się napięcia U₁, U₂, U₃, ... . Działanie fotopowielacza polega na tym, że foton, padając na fotokatodę, wybija z niej elektrony, te zaś trafiają na dynodę, wywołując wtórną emisję elektronów, przy czym każdy z elektronów wybija z dynody kilka nowych. Proces ten powtarza się na kolejnych dynodach i w efekcie otrzymuje się wielokrotne wzmocnienie fotoprądu. Fotopowielacze mają zastosowanie w spektrofotometrach UV-VIS wyższej klasy, a także w innych przyrządach optycznych, np. w kwantomerach czy spektrofotometrach absorpcji atomowej.

6. Wskaźnik lub rejestrator: galwanometr, samopis, potencjometr, oscyloskop.

4. Kolorymetry.

Kolorymetry, jako pierwsze absorpcjometry, odegrały w analizie instrumentalnej ważną rolę.

Na szczególną uwagę zasługuje kolorymetr typu Duboscqa. Pomiar stężenia roztworu badanego, za pomocą tego przyrządu, przeprowadza się metodą zrównania barw. Osiąga się to na drodze zmian grubości warstwy roztworu badanego. Światło wysyłane przez żarówkę, ulega odbiciu od płytki ze szkła mlecznego i oświetla równomiernie dna naczyń pomiarowych. Jedno naczynie napełnia się roztworem badanym, a drugie roztworem tej samej substancji, o znanym stężeniu. Światło po przejściu przez naczynie pomiarowe i układ optyczny wpada do okularu, w którym pole widzenia, w postaci koła, podzielone jest linią na połówki. Oba naczynia pomiarowe są umieszczone na odpowiednich wspornikach, połączonych z mechanizmem umożliwiającym pionowe podnoszenie i opuszczanie naczyń. Grubość warstw roztworów reguluje się za pomocą szklanych walców. Pomiar polega na doprowadzeniu obu połówek pola widzenia do oświetlenia o identycznym natężeniu.

Na podstawie otrzymanych wyników, grubości warstw roztworu badanego d₁ i wzorcowego d₂, można obliczyć stężenie badanego roztworu, korzystając z wzoru: c₁d₁ = c₂d₂.

5. Absorpcjometry fotoelektryczne.

Detektorami w absorpcjometrach fotoelektrycznych są fotoogniwa, fotokomórki lub fotopowielacze.

Do grupy absorpcjometrów fotoelektrycznych zalicza się przyrządy o różnorodnych rozwiązaniach konstrukcyjnych. Można je podzielić na absorpcjometry jedno- i dwuwiązkowe, w zależności od tego, ile wiązek promieniowania biegnie od źródła do detektora. W absorpcjometrach dwuwiązkowych istnieje możliwość jednoczesnego porównywania absorbancji próbki i wzorca.

Inny podział absorpcjometrów uwzględnia sposób wykonania pomiarów. Można tu rozróżnić absorpcjometry wychyleniowe i kompensacyjne. Do pierwszej grupy należą aparaty działające na zasadzie wychylenia wskazówki galwanometru wzdłuż podziałki, skalowanej w jednostkach absorbancji i procentach transmitancji. Do drugiej grupy należą przyrządy pracujące na zasadzie kompensacji potencjometrycznej. Są to aparaty typu zerowego, a ich wskazania są niezależne od wahań napięcia prądu, zasilającego źródło światła.

Spośród dużej liczby produkowanych absorpcjometrów, stosunkowo najbardziej rozpowszechnionym w Polsce jest spektrokolorymetr „Spekol” produkowany przez Zakłady C. Zeiss w Jenie. Jest to absorpcjometr jednowiązkowy, wychyleniowy, o niewielkich rozmiarach i prostej obsłudze. Umożliwia on pomiary absorbancji w zakresie 365 - 750 nm. Zasadniczy przyrząd jest zaopatrzony w różne przystawki, pozwalające przeprowadzić miareczkowanie spektrofotometryczne, turbidymetryczne, fluorescencyjne oraz pomiar remisji, stopnia zmętnienia i natężenia fluorescencji.

Światło, emitowane przez źródło, którym jest lampa wolframowa (6 V, 30 W) na zakres 420 - 750 nm (lub lampa rtęciowa HQE-40 na zakres 365 - 750 nm), przechodzi przez kondensor i po odbiciu od zwierciadła wchodzi przez szczelinę wejściową do kolimatora. Po przejściu przez układ achromatyczny pada na monochromator, którym jest siatka dyfrakcyjna. Za pomocą odpowiedniego układu dźwigni można obracać siatkę dyfrakcyjną i dzięki temu przepuszczać przez szczelinę wyjściową monochromatora wiązkę o żądanej długości fali. Szerokość spektralna przepuszczanych przez szczelinę wiązek monochromatycznych wynosi 12 nm. Wybrana długość widma, po przejściu przez soczewkę achromatyczną, trafia na szczelinę wyjściową i po przejściu przez kiuwetę z roztworem badanym i filtr barwny do pochłaniania promieniowania cieplnego pada na detektor. W standardowym przyrządzie detektorem jest fotoogniwo selenowe. Powstały w fotoogniwie fotoprąd ulega wzmocnieniu we wzmacniaczu tranzystorowym i dostaje się do urządzenia pomiarowego.

6. Spektrofotometry.

Spektrofotometry UV-VIS należą do absorpcjometrów najwyższej klasy. Dzięki zastosowaniu pryzmatów i siatek dyfrakcyjnych otrzymuje się promieniowanie o wąskiej szerokości spektralnej, a przez wprowadzenie dodatkowych filtrów, praktycznie monochromatyczne. Detektorami w tych przyrządach są fotokomórki, z odpowiednimi układami wzmacniającymi fotoprąd, i fotopowielacze.

Ze względu na sposób rejestracji, spektrofotometry UV-VIS można podzielić na dwie grupy:

• spektrofotometry punktowe, w których absorbancję odczytuje się metodą wychyleniową, na skali galwanometru lub częściej metodą kompensacyjną, równoważąc układ pomiarowy za pomocą potencjometru, wyskalowanego w jednostkach absorbancji i procentach transmitancji,

• spektrofotometry samopiszące, rejestrujące widma absorpcji w układzie %T = f (λ). Są to urządzenia o bardzo skomplikowanej budowie. Są to aparaty dwuwiązkowe, o szeroko rozbudowanym układzie optycznym, umożliwiającym dobrą monochromatyzację widma. Dzięki zastosowaniu, jako detektorów, fotopowielaczy charakteryzują się większą czułością.

7. Zastosowanie spektrofotometrii UV-VIS.

Spektrofotometria UV-VIS znalazła różnorodne zastosowanie w wielu dziedzinach chemii. Jest powszechnie stosowana w analizie ilościowej, a także do identyfikacji związków organicznych i do badania związków kompleksowych.

Analiza ilościowa.

Pomiar zawartości badanego składnika metodą spektrofotometryczną jest oparty na prawach absorpcji. Dokładność oznaczeń zależy od właściwego przygotowania roztworów wzorcowych, a także od dobrania optymalnej długości fali , przy której ma być wykonany pomiar spektrofotometryczny. Optymalną długość fali dobieramy za pomocą krzywej absorpcji, przedstawiającej zależność absorbancji od długości fali światła (A = f (λ)). Pomiary spektrofotometryczne wykonuje się najczęściej przy długości fali odpowiadającej λ_max. Trudniejszy jest wybór analitycznej długości fali, gdy w celu oznaczenia kationu metalu M otrzymujemy barwny kompleks ML i gdy zarówno kompleks jak i odczynnik L absorbują promieniowanie. Należy wówczas wykreślić krzywą absorpcji odczynnika i badanego kompleksu. Analityczną długość fali ustalamy wówczas przy λ_opt, gdzie różnica absorbancji odczynnika i badanego kompleksu ΔA jest największa.

Ilościowe oznaczanie badanego składnika przeprowadza się najczęściej metodą algebraiczną, metodą krzywej wzorcowej lub miareczkowania spektrofotometrycznego.

1. Metoda algebraiczna.

Stężenie c_x oznaczanego składnika oblicza się bezpośrednio ze wzoru:

c_x =

Współczynnik absorpcji ε można wyznaczyć mierząc, przy danej długości fali λ_max, absorbancję kilku roztworów wzorcowych i z tych danych obliczyć wartość ε_śr.

Inny sposób oznaczania stężenia c_x analizowanej substancji polega na porównaniu absorbancji roztworu badanego i roztworu wzorcowego o znanym stężeniu substancji oznaczanej. Pomiar absorbancji roztworów przeprowadza się przy tej samej długości fali w naczyniach o takiej samej grubości warstwy.

Absorbancję tych dwóch roztworów można wyrazić wzorami:

A_x = ε_λc_xd_x

A_wz = ε_λc_wzd_wz

Dzieląc równania stronami otrzymuje się:

gdy d_x = d_wz, a ε_λ = const, otrzymuje się:

stąd

Sposób porównywania absorbancji stosuje się często w przypadku pojedynczych oznaczeń. Modyfikacją tej metody, dającą pewniejsze wyniki, jest sposób z dwoma roztworami wzorcowymi c₁ i c₂ tak dobranymi, aby A₁ < A_x < A₂, wówczas nieznane stężenie roztworu można obliczyć z wzoru:

2. Metoda krzywej wzorcowej.

Polega ona na sporządzeniu serii (4 - 6) roztworów wzorcowych oznaczanej substancji, o różnych stężeniach, zmierzeniu absorbancji tych roztworów, przy wybranej długości fali i wykreśleniu krzywej wzorcowej A = f (c). Krzywa wzorcowa (krzywa analityczna) jest linią prostą, jeżeli roztwory spełniają prawa absorpcji.

W celu określenia stężenia c_x badanej substancji należy, w tych samych warunkach, oznaczyć jej absorbancję A_x i z krzywej wzorcowej odczytać szukane stężenie c_x.

Zarówno w metodzie algebraicznej jak i w metodzie krzywej wzorcowej jako roztwór odniesienia można stosować albo rozpuszczalnik, albo wzorcowy roztwór substancji badanej.

W metodzie fotometrii bezpośredniej roztworem odniesienia jest rozpuszczalnik lub roztwór, sporządzony z rozpuszczalnika i stosowanych w danym oznaczeniu odczynników. Przyrząd ustawia się na 0% transmitancji, gdy fotokomórka znajduje się w ciemności (zamknięta przesłona), i na 100% transmitancji, gdy promieniowanie przechodzi przez roztwór odniesienia (rozpuszczalnik). Po takim ustawieniu przyrządu można mierzyć dowolne natężenie promieniowania, przechodzącego przez roztwór badany, w zakresie 0 - 100% transmitancji.

W tym konwencjonalnym sposobie postępowania popełnia się jednak duży błąd, szczególnie wtedy, gdy mierzone są roztwory bardzo stężone (T < 20%) lub bardzo rozcieńczone (T > 65%). W takich przypadkach stosuje się tzw. metodę spektrofotometrii różnicowej. W metodzie tej roztworem odniesienia jest roztwór badanej substancji o stężeniu c₁. Zerową transmitancję ustawia się tu tak samo jak w metodzie fotometrii bezpośredniej, tzn. dla zaciemnionego detektora promieniowania. Natomiast transmitancję T = 100% nastawia się na najmniej stężony roztwór wzorcowy c₁. takie postępowanie pozwala na rozszerzenie skali przyrządu, a tym samym na zwiększenie dokładności pomiarów.

Można wykazać, że absorbancja różnicowa jest proporcjonalna do różnicy stężeń próbki badanej i wzorcowej:

A = ε d (c_x - c₁)

Analogiczny tok postępowania można przyjąć w przypadku roztworów rozcieńczonych (T > 65%). Zerową transmitancję należy nastawić na najbardziej stężony roztwór wzorcowy, a T = 100% na czysty rozpuszczalnik.

Jeżeli w metodzie konwencjonalnej transmitancja wzorca (c₁) jest równa 90%, a transmitancja próbki badanej (c_x) 93%, to po rozszerzeniu skali przyrządu dla c₁ uzyskamy T = 0%, a dla c_x otrzymamy T = 30%.

3. Metoda miareczkowania spektrofotometrycznego.

Miareczkowanie spektrofotometryczne stosuje się w celu ustalenia punktu końcowego miareczkowania wówczas, gdy zmiana barwy, towarzysząca temu punktowi, nie jest dostatecznie wyraźna, aby ją zaobserwować wizualnie, lub przebiega stopniowo, w miarę dodawania odczynnika miareczkującego. Pomiar polega na kolejnym mierzeniu absorbancji, zmieniającej się podczas miareczkowania roztworu badanego. Proces miareczkowania przedstawia się graficznie. Wykres sporządza się w układzie: A = f (V), gdzie V - objętość roztworu miareczkującego.

Miareczkowanie przeprowadza się przy określonej długości fali w specjalnie do tego celu przystosowanych spektrofotometrach (np. Spekol z przystawką do miareczkowania Ti lub TiMi), w których roztwór zawarty w kiuwecie jest mieszany za pomocą mieszadełka elektromagnetycznego. W metodzie miareczkowania spektrofotometrycznego otrzymuje się różne typy krzywych miareczkowania.

Miareczkowanie spektrofotometryczne można prowadzić zarówno bez indykatora, jak również wobec indykatora.

Miareczkowanie bez indykatora. Oto kilka przykładów takich miareczkowań:

a) oznaczana substancja A i produkt miareczkowania AB nie absorbują światła, a odczynnik miareczkujący B absorbuje światło. Krzywa miareczkowania ma wówczas przebieg przedstawiony na rysunku. Przykładem jest miareczkowanie jonów Fe²⁺ za pomocą KMnO₄ przy λ = 550 nm.

A

PK V, ml

b) produkt miareczkowania AB absorbuje światło, a substancja oznaczana A i odczynnik miareczkujący B nie absorbują, np. miareczkowanie małych ilości Cu²⁺ za pomocą EDTA przy długości przy λ = 260 nm. Krzywa miareczkowania przyjmuje postać przedstawioną poniżej:

A

c_L/c_M

Podobny przebieg ma krzywa miareczkowania Fe³⁺ za pomocą NH₄SCN.

c) oznaczania substancja A pochłania światło, a odczynnik miareczkujący B i produkt reakcji AB nie pochłaniają. Przykładem jest miareczkowanie dwuchromianu za pomocą jonów Fe²⁺ przy λ = 350 nm. Krzywa miareczkowania wygląda następująca:

A

PK V, ml

4. oznaczana substancja A i odczynnik miareczkujący B pochłaniają światło, a produkt reakcji AB nie pochłania światła. Krzywa ma wówczas przebieg następujący:

A

PK V, ml

Miareczkowanie wobec indykatora.

Jeżeli żaden ze składników reakcji A, B, AB nie pochłania promieniowania, to często stosuje się indykator Y, który pozwala uchwycić punkt końcowy miareczkowania. Indykatorem takim może być substancja, która tworzy barwne połączenia typu AY, BY lub ABY; np. NH₄SCN tworzy z jonami Fe³⁺ barwny kompleks, wykazujący maksimum absorbancji przy λ = 525 nm. Kompleks ten jest jednak mniej trwały od kompleksu Fe³⁺ - EDTA i dlatego w procesie miareczkowania barwnego rodanku żelazowego za pomocą EDTA następuje odbarwienie roztworu.

W analogiczny sposób można miareczkować za pomocą EDTA: Bi³⁺ wobec tiomocznika przy λ = 400 nm, Cu²⁺ wobec NH₄OH przy λ = 630 nm.

Miareczkowanie spektrofotometryczne charakteryzuje się wieloma zaletami, a mianowicie:

1. można w sposób szybki, prosty i z dużą dokładnością przeprowadzić oznaczenia,

2. można miareczkować roztwory rozcieńczone (c < 10^-5 mol/dm³), a także silnie zabarwione. Absolutne ilości substancji oznaczane tą metodą są rzędu 10^-1 - 10^-8 g.

3. miareczkowanie spektrofotometryczne można stosować w takich przypadkach, gdy trudno rozróżnić zmianę barwy za pomocą wzroku,

4. miareczkowanie to można łatwo zautomatyzować.

Badanie składu związków kompleksowych.

Spektrofotometria jest ważną metodą pomiarową stosowaną do badania równowag w roztworach. Wykorzystuje się ją w szczególności do wyznaczania stałych dysocjacji kwasów i zasad oraz do ustalania składu i stałych trwałości związków kompleksowych. Związki kompleksowe powstają w wyniku współdziałania jonu centralnego M z ligandem L w myśl równania:

mM + nL M_mL_n

Badanie procesów kompleksowania sprowadza się do identyfikacji powstających kompleksów, ustalenia ich składu, ładunku oraz charakterystyki termodynamicznej, z którą związane jest obliczenie wartości stałej równowagi reakcji, określającej trwałość kompleksu. Ustalenie składu kompleksu M_mL_n sprowadza się do wyznaczenia wartości współczynników m i n. W przypadku, gdy m = 1, powstający kompleks nazywamy jednordzeniowym, gdy m > 1 - wielordzeniowym. Do najczęściej stosowanych metod wyznaczania składu kompleksu należą: metoda stosunków molowych i metoda zmian ciągłych (metoda serii izomolowych).

W metodzie stosunków molowych mierzy się absorbancję serii roztworów, które zawierają zmienne ilości jednego składnika, a stałą ilość drugiego. Z kolei sporządza się wykres przedstawiający absorbancję jako funkcję stosunku molowego liganda i jonu centralnego A = f (c_L/c_M). Punkt przecięcia na krzywej odpowiada stosunkowi molowemu składników kompleksu.

W metodzie serii izomolowych przygotowuje się serię roztworów o zmiennych składach molowych obydwu składników, ale przy ich stałym stężeniu sumarycznym. Otrzymana krzywa absorpcji wykazuje maksimum przy takim stosunku molowym, który odpowiada składowi kompleksu.

11

---