Nazwisko i imię:

Data wykonania:

Kierunek:

Zaliczenie:

1. Chromatografia cienkowarstwowa aminokwasów TLC

Cel ćwiczenia:

Identyfikacja oraz jakościowa analiza aminokwasów w roztworze wodnym metodą TLC.

Zasada pomiaru:

Rozdział w chromatografii cienkowarstwowej odbywa się na płytce z folii aluminiowej pokrytej warstwą żelu krzemionkowego, który stanowi fazę stacjonarną. Rozdział taki możliwy jest dzięki zróżnicowanej budowie aminokwasów (np. dodatkowe grupy funkcyjne), która nadaje im pewne charakterystyczne własności (pKa, hydrofobowość).

Aby wykryć i zidentyfikować rozdzielone aminokwasy niezbędne jest przeprowadzenie reakcji ninhydrynowej (ponieważ daje ona barwny efekt na powierzchni płytki do TLC), która pozwala na wykrycie do 10^-9 mola substancji. Zabarwienie po reakcji z ninhydryna pojawia się w temp. 80-100^oC.

Materiały i sprzęt:

1. Płytka do chromatografii TLC

2. linijka i ołówek

3. wzorce aminokwasów (0,5%) i kapilarki (μl)

4. komora chromatograficzna

5. eluent (1-butanol-kwas octowy- woda; 4:1:1)

6. wywoływacz (0,3% roztwór ninhydryny w acetonie)

Wykonanie:

• Przygotowanie płytki:

Na płytkach, ok. 1cm od dolnego brzegu zaznaczyć ostrożnie miękkim ołówkiem linię startu. W odstępie ok. 10 mm na linii startu zaznaczyć punkty nanoszenia aminokwasów. Na tak przygotowane płytki nanieść kapilarkami odpowiednio wzorcowe i analizowane aminokwasy, w objętości 1 μl i w taki sposób by średnica plamki nie przekraczała 3mm.

• Rozwinięcie chromatogramu:

Do komory chromatograficznej wlać co najmniej 30 min przed włożeniem płytek eluent, by wytworzyła się warstwa ok. 5mm. Płytki umieścić w komorze pionowo uważając by linia startu nie była zanurzona w cieczy oraz żeby boczne krawędzie płytek nie dotykały ścianek komory. Po szczelnym zakryciu komory chromatograf rozwija się ok. 40-60 minut. Gdy poziom eluentu znajdzie się w odległości ok. 5 mm od górnej krawędzi płytki, można wyjąć je z komory i ołówkiem zaznaczyć linię czoła. Płytki wysuszyć pod wyciągiem.

• Wywołanie chromatogramu:

Na suche płytki nanieść roztwór ninhydryny. Płytki ogrzewamy gorącym strumieniem powietrza. W wyniku reakcji na płytkach pojawiają się zabarwione na odcienie różu i fioletu plamki - należy znów delikatnie zaznaczyć ołówkiem położenie i środek każdej z nich.

• Identyfikacja aminokwasów:

Należy zmierzyć odległość od miejsca startu do środka każdej plamki, czyli drogę przebyta przez każdy aminokwas. Mierzymy też drogę przebyta przez rozpuszczalnik. Na podstawie otrzymanych danych obliczamy współczynnik Rf każdego z aminokwasów korzystając ze wzoru:

Rf = l _plamki/ l _fazy

WZORCE
	I					II					ŚREDNIA
	l plamki		l fazy	Rf		l plamki			l fazy	Rf
PHE	20		51	0,3922		20			50	0,4000	0,3961
ILE	18		51	0,3529		18			50	0,3600	0,3565
ALA	6		51	0,1176		5			50	0,1000	0,1088
SER	4		51	0,0784		4			50	0,0800	0,0792
GLN	5		51	0,0980		3			50	0,0600	0,0790
ARG	1,5		51	0,0294		1,5			50	0,0300	0,0297
LYS	1		51	0,0196		1			50	0,0200	0,0198
NIEZNANY AMINOKWAS 4
	1						2					ŚREDNIA
		l plamki	l fazy			Rf		l plamki	l fazy		Rf
X	4	55			0,0727		4	55		0,0727		0,0727
Y	19	55			0,3455		18	55		0,3273		0,3364

Wnioski:

Porównując współczynniki Rf nieznanych aminokwasów X i Y ze współczynnikami aminokwasów wzorcowych, z dużym prawdopodobieństwem mogę uznać, że w analizowanej próbce 4 znajdowały się: glutamina (X) oraz izoleucyna (Y).

2. Analiza HPLC zawartości kwasu salicylowego w materiale roślinnym.

Cel ćwiczenia:

Analiza zawartości kwasu salicylowego w liściach dwu odmian tytoniu szlachetnego: Bel B - ozonotolerancyjnej i Bel W3 wrażliwej na ozon, które zostały uprzednio poddane dwutygodniowej ekspozycji na działanie ozonu troposferycznego w warunkach naturalnych na terenie Poznania.

Określenie różnic między detekcją fluorymetrycznąa aabsorpcjometryczną w analizie chromatograficznej.

Zasada pomiaru:

Kwas salicylowy pełni u roślin funkcję regulatora wielu procesów metabolicznych (w tym reakcji na bodziec stresowy), jak również przenośnika/ transduktora wiadomości o stresie w ujęciu lokalnym i systemicznym. W ostatnich latach wykazano ścisłą zależność między nasileniem bodźca a akumulacją kwasu salicylowego w organach roślin w warunkach kontrolowanych co z kolei umożliwia oszacowanie ogólnego efektu stresowego wywoływanego przez środowisko u zasiedlających je roślin.

Rys.1. krzywa wzorcowa kwasu salicylowego

Po przeprowadzeniu ekstrakcji z materiału roślinnego, kwas salicylowy w formie wolnej oznacza się metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej z wykorzystaniem detekcji fluorymetrycznej.

Materiały i sprzęt:

1. wysokosprawny chromatograf cieczowy firmy Waters, Milford, USA typ Alliance 2696

2. detektor absorpcjometryczny PhotoDiode Affay Waters 2996

3. detektor fluorymetryczny Multi-λ Fluorescencje Detector Waters

4. kolumna chromatograficzna C₁₈ firmy Waters, Spherisorb ODS2, 3 μm x 4,6 mm x 100mm

5. faza ruchoma: bufor octanowy (pH 5,0)

6. komputer z oprogramowaniem M

7. Millenium

Warunki rozdziału chromatograficznego:

- prędkość -przepływu fazy ruchomej przez kolumnę: 1,5cm/min

- elucja izokratyczna

- czas analizy: 12min

- Objętość nastrzyku: 10 μl (krzywa wzorcowa w zakresie 0,01-0,02 ng/μl dla objętości nastrzyku 10 μl)

Warunki detekcji:

- długość fali wzbudzenia/ absorpcji: 295 nm

- długość fali emisji: 405 nm

Ekstrakcja kwasu salicylowego z liści tytoniu szlachetnego:

1. zamrożony liść umieszczamy w ochłodzonym moździerzu i rozcieramy w ciekłym azocie do uzyskania proszku

2. odważamy 0,3g rozdrobnionej tkanki i zalewamy 5ml 90% metanolu

3. mieszać i bonifikować co 10min

4. odwirować i odparować do uzyskania suchego ekstraktu

5. pozostałość rozpuszczamy w 500 μl fazy ruchomej, filtrujemy i umieszczamy w fiolce autosamplera.

Oznaczenia zawartości kwasu salicylowego:

1. zamontowanie kolumny wraz ze stalowym filtrem prekolumnowym (0,5 μl)

2. uruchomienie degazera próżniowego

3. przemycie układu i kolumny acetonitrylem, wodą i buforem octanowym

4. wprowadzenie parametrów analizy z komputera na aparat

5. nastrzyknięcie próbek

6. Analiza zebranych danych, tj. porównanie chromatogramu z detektora fluorymetrycznegio i absorpcyjnego przy długości fali wzbudzenia oraz w ujęciu 3D

7. identyfikacja kwasu salicylowego przez porównanie czasu retencji piku i wzorca

8. analiza ilościowa kwasu salicylowego metodą krzywej wzorcowej dla pola powierzchni pod pikiem.

9. kondycjonowanie kolumny buforem, woda i acetonitrylem

10. odłączenie kolumny chromatograficznej.

Wyniki pomiaru:

	czas retencji	powierzchnia piku
roztwór wzorcowy 0,1ng/ml	6,438	351275
czysty kwas w formie wolnej	6,331	3584085
całkowity kwas salicylowy po uwolnieniu z glikozydów	6,367	4649735

• Obliczam stężenie wolnego kwasu salicylowego:

351275 --- 0,1 ng/ml

3584085 --- x

X=(3584085*0,1)/ 351275

X= 1,0203 [ng/ml]

• Obliczam stężenie całkowitego kwasu po uwolnieniu z glikozydów:

351275 --- 0,1 ng/ml

4649735 --- x

X= (4649735*0,1)/351275

X=1,3236 [ng/ml]

Rys.2 czysty kwas w formie wolnej

Rys.3. całkowity kwas salicylowy po uwolnieniu z glikozydów

Rys.4 roztwór wzorcowy 0,1ng/ml

Wnioski:

Zawartość kwasu salicylowego w liściach tytoniu ozonotolerancyjnego i wrażliwego na ozon wynoszą odpowiednio 1,0203 oraz 1,3236 [ng/ml]. Otrzymane dane zgadzają się z wynikami otrzymanymi przez badaczy i potwierdzają zależność zawartości kwasu salicylowego od odporności na stres rośliny.

Detekcja fluorymetryczna jest metodą bardziej czułą, wykazuje większą selektywność niż detekcja absorpcyjna, gdyż nie wszystkie związki ulegają fluorescencji. Pomiar fluorescencji daje również piki o wyższej intensywności niż w pomiarze metodą absorpcyjną.

Niewielkie różnice w czasie retencji kwasu salicylowego można wyjaśnić wpływem temperatury otoczenia na aparaturę i analizę. Nie wpływają one jednak na dokładność analizy.

W przypadku korzystania z stężenia wzorca 0,1 ng/ml do obliczania znacznie wyższych stężeń, należy empirycznie sprawdzić liniowość zależności w zakresie wyższym niż największe zmierzone stężenie.

---