Tomasz Koliński, gr.2.
Sprawozdanie z ćw.1. Izolacja DNA plazmidowego i rozdział na żelu agarozowym
Użyty szczep i plazmid: MG1255 [pCattTrE18]
Liza termiczna i alkaliczna: etapy wspólne
Bakterie zaszczepiono w 10ml pożywki płynnej LB, dodano antybiotyku i hodowano przez noc w temperaturze 37oC z wytrząsaniem. 1,5 ml hodowli bakteryjnej wirowano.
Liza termiczna
Zawieszono osad w 300 µl buforu STET (lizuje komórkę; zawiera Triton X-100, który powoduje przyłączenie DNA chromosomowego do błony cytoplazmatycznej). Dodano 25 µl lizozymu, w celu zniszczenia ścian komórek bakteryjnych. Wymieszano i umieszczono na 40 sekund w łaźni wodnej w celu denaturacji DNA. Wirowano i przeniesiono do nowej probówki. Dodano 420 µl izopropanolu i 40 µl octanu potasu (w celu wytrącenia DNA). Zworteksowano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wirowano. Osad zawieszono w 100 µl buforu TE (lizuje; zarówno TE jak i STET zawierają EDTA, kótry chelatuje 2-wartościowe jony, konieczne do aktywacji nukleaz). Dodano 100 µl roztworu fenol-chloroform i mieszano (w celu oddzielenie DNA i związanych z nim białek). Dodano 400 µl mieszaniny fenol-chloroform, worteksowano i wirowano. Zebrano górną fazę i przeniesiono do nowej probówki. Dodano 01 objętości octanu sodu i 2,5 objętości etanolu 96% (ponowne wytrącenie DNA). Wirowano, usunięto supernatant i osuszono. Dodano 1 ml 70% etanolu, wirowano i usunięto supernatant. Odparowano resztki etanolu. Osad zawieszono w 20 µl wody.
Liza alkaliczna
Po wirowaniu odrzucono supernatant, a osad zawieszono w 100 µl buforu I (zawiera jonowy detergent Tris - do lizy komórki oraz EDTA, który chelatuje 2-wartościowe jony, konieczne do aktywacji nukleaz). Dodano 200 µl buforu lizującego (powoduje rozkład ściany), wymieszano i inkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wirowano, zebrano górną fazę do nowej probówki. Dodano 0,7 ml 96% etanolu (wytrąca DNA) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Wirowano, odrzucono supernatant. Do osadu dodano 0,5 ml 70% etanolu (w celu dokładnego wytrącenia DNA i rozdziału na 2 fazy ), wirowano. Odparowano resztki etanolu. Osad zawieszono w 20 µl wody.
Elektroforeza agarozowa.
Zważono 1 g agarozy i zawieszono w 100 ml buforu TAE 0,5-raza stężonego (przewodzi prąd). Agarozę rozpuszczono poprzez zagotowanie mieszaniny w kuchence mikofalowej. W aparacie umieszczono grzebień. Schłodzono., wylano na płytkę do aparatu do elektroforezy. Po zastygnięciu żelu, wyjęto grzebień. Do aparatu wlano 0,5-raza stężony bufor TAE.
Roztwór DNA wymieszano z barwnikiem obciążającym i naniesiono do studzienek w żelu. W pierwszej studzience umieszczono drabinę. Prowadzono rozdział (kierunek migracji DNA - od elektrody ujemnej do dodatniej). Po zakończeniu rozdziału barwiono żel bromkiem etydyny (interkaluje DNA i świeci się w świetle UV). W UV zrobiono zdjęcie umieszczone i opisane poniżej:
Wyszukiwarka