Wykład 7

• Metody oceny indukcji mutacji genowych:

• Analiza rewersji mutacji genowych u bakterii

• In vitro indukcja mutacji genowych w komórkach ssaków

• In vivo „spot test” u myszy(test zmian barwy namaszczenia/plam na sierści)

• Metody oceny indukcji aberracji chromosomowych:

• In vitro test na aberracje chromosomowe

• Test mikrojąderkowy

• Test na aberracje chromosomowe w szpiku kostnym

• Badanie translokacji dziedzicznych

• Test u gryzoni dominujący letalny

• Testy indukcji mutacji genowych(analiza rewersji mutacji genowych)

• Test na mutacje odwrotne u Salmonella lub E.coli

• In vitro komórki ssaków(geny reporterowe HPRT, TK)

• Badanie mutacji w ograniczonej liczbie genów - identyfikacja poprzez odpowiednią selekcję w całym genomie

• Test Amesa

• Test Salmonella Ames 1973r

• Do skriningowego wykrywania aktywności genotoksycznej

• Szczepy Salmonella thypimurium lub Escherichia coli z mutacjami punktowymi w syntezie aa (histydyny) - rewersja-> przywrócenie zdolności syntezy aa

• Ekspozycja na czynnik - mutacje powrotne umożliwiają syntezę histydyny - zdolność wzrostu na podłożu minimalnym - test rewersji mutacji

• Dodatkowe cechy szczepów bakteryjnych:

• Większa przepuszczalność ściany komórkowej

• Mniejsza zdolność naprawy DNA

• Zwiększenie mutagenezy zależnej od procesów błędnej naprawy

• Dodatkowo oporność na antybiotyki

• Test:

• Tani,

• Szybki,

• Prosty do wykonania

• Brak właściwej aktywacji metabolicznej + frakcja mikrosomalna S9.

• Praktycznie aplikacje bakteryjnych testów genotoksycznych:

• Testowanie właściwości genotoksycznych nowych związków

• Skrining zanieczyszczeń genotoksycznych produktów przemysłowych

• Produkty genotoksyczne w żywności

• Monitorowanie środowiska(powietrze, woda, gleba)

• Poszukiwanie niegenotoksycznych lub mniej genotoksycznych analogów znanych substancji chemicznych

• Analiza działania synergistycznego pomiędzy (nie)genotoksycznymi związkami

• Badania procesów komórkowych i molekularnych odpowiedzialnych za mutagenezę

• Indukcja mutacji genowych in vitro w komórkach ssaków

• Genom ssaków 32 000 genów, ale do analizy mutacji nadaje się niewiele, ponieważ muszą to być geny reporterowe

• Mutanty muszą mieć ściśle określony łatwo rozpoznawalny fenotyp:

• Np. czerwone oczy u Drosophila melanogaster

• Oporność na związki toksyczne

• Fenotyp musi być dominujący(lub heterozygota dla danej mutacji)

• Frekwencja mutacji spontanicznych dla większości genów w komórce wynosi 1x 10⁶-10⁷

• Geny „non essential”(niekonieczne)

• HPRT fosforybozylotransferaza hipoksantynow- guaninowa

• TK kinaza tymidynowa

• APRT transferaza adenino…

• Procedura testu:

• Gen HPRT

• W chromosomie X, 9 eksonów zawierających 44kb (34kb u gryzoni)

• Analiza w liniach komórkowych oraz in vivo u limfocytów

Normalny szlak:

Guanina + PPi HPRT GMP DNA

Hipoksantyna IMP RNA

Test:

6-guanina 6-tioGMP komórka umiera

Mutacja/nieaktywny enzym komórka przeżywa

• HPRT (-/-) - mutacja - klinicznie powoduje Lesch-Nyhan syndrome, który objawia się zaburzeniami umysłowymi, porażeniem mózgu, destrukcyjnymi zachowaniami

• Sekwencjonowanie genomu:

• Linia dzika - dominujące mutacje: tranzycje, transwersje

• Mutant - dominująca mutacja: delecja

• Inny rodzaj testu wykrywania genotoksyczności w komórkach ssaków In vitro - z wykorzystaniem MLA(Mouse lymphoma assay)

Kinaza tymidynowa ekspozycja na dany czynnik ^t manifestacja zmiany

Typ dziki

Kolekcjonowanie komórek

Wysiew i hodowla komórkowa

Medium normalne Medium z czynnikiem selekcyjnym

(analog tymidyny) można wyodrębnić mutanty. Kolonie wolno rosnące - delecja

• Wykrywanie mutagennych właściwości związków chemicznych(można oszacować mutagenność, czego nie ma na przykład w teście przeżywalności)

• „Spot test”

• Test wykonywany u ciężarnych myszy

• Umożliwia detekcję mutacji somatycznych u mysich płodów eksponowanych na działanie danej substancji

• Stosuje się pojedynczą iniekcję w 4-8 dniu ciąży

• W 4 tygodniu po porodzie ocenia się zmianę zabarwienia sierści

• Komórki docelowe: melanoblasty i geny odpowiedzialne za pigmentację sierści

• Płody - heterozygoty, wiele genów warunkuje kolor sierści

• Mutacja lub utrata allelu w melanoblaście - ekspresja fenotypu recesywnego

• Ilość łat/plam w odniesieniu do kontroli - mutagenność związku

• Pojedyncze iniekcje w 8-10 dniu ciąży

• Analiza zmian ubarwienia - 4 tydz. po porodzie

Testowanie nowych czynników genotoksycznych

Testy bakteryjne(np. Amesa)

+

Testy In vitro(np. MLA, test mikrojąderkowy)

+

Test In vivo

+

Właściwości mutagenne

• Długoterminowe badania kancerogenności

• Zwierzęta pod obserwacją przez większość ich życia

• Wykorzystuje się głównie gryzonie(myszy, szczury, chomiki)

• Endogeniczne linie nie powinny być używane

• Zwierzęta obydwu płcy

• 50 zwierząt dla każdej grupy

• Wykorzystanie gryzoni wiąże się z:

• Niską liczbą nowotworów spontanicznych

• Dobrze poznaną fizjologią i patologią

• Swoistą wrażliwością gatunkową - zalecane 2 gatunki zwierząt:

• Chomiki - nowotwory pęcherza, piersi, układu oddechowego

• Myszy - nowotwory wątroby

• Szczury - …

• Zasada zastosowania:

• Jak najwięcej informacji przy jak najmniejszej liczbie testów

• Jak najmniej zwierząt

• Przy dostępności niemutagennego związku - nie prowadzi się badań

• Związek mutagenny może być stosowany jeżeli jego działanie daje więcej korzyści niż zagrożeń

• Analiza adduktów DNA

• Pozwala poznać mechanizm działania czynników genotoksycznych:

• Jakie addukty?

• Które addukty są odpowiedzialne za efekty biologiczne?

• Czy są substratem naprawy DNA?

• Czy powstają „secondary lesion”?

• Stabilne addukty DNA są bardziej przydatne dla celów biomonitoringu

• Poziom adduktów DNA jest dużo mniejszy niż w warunkach laboratoryjnych

• Biomonitoring (…)

• Metody analizy uszkodzeń DNA

• Pojedyncze i podwójne pęknięcia DNA:

• Histon γH2AX

• Elektroforeza pulsacyjna

• Zasada: zmiana kierunku pola elektrycznego(o 90 lub 180⁰) zmusza DNA do migracji w żelu agarozowym(duże molekuły migrują wolniej) oddziela fragmenty o różnej długości

Hodowla kom. czynnik stresowy liczenie kom. 10⁶kom/100µl agarozy PFGE

• Metoda kometowa

• Zasada: Elektroforetyczny rozdział DNA w żelu agarozowym, możliwość oszacowania fragmentacji w pojedynczej komórce.

• Ale fragmentacja DNA ≠ uszkodzenie DNA

Hodowla kom. Czynnik stresowy zawieszenie szkiełko mikroskopowe/ w agarozie liza elektroforeza warunki alkaliczne warunki neutralne pojedyncze pęknięcia podwójne pęknięcia

Po elektroforezie - analiza na szkiełku( mierzy się długość głowy i ogona - kształt komety)

Długość ogona - ocena fragmentacji

pH- bardzo ważne! (pojedyncze pęknięcia zawsze w środowisku alkalicznym, a podwójne pęknięcia w neutralnym)

Pomiar komórek uszkodzonych - wykorzystanie enzymów, które rozpoznają i naprawiają uszkodzenia

Inny wariant:

Myszy poddane hodowla komórkowa liza elektroforeza analiza

Czynnikowi stresowemu z tkanek myszy (alkaliczna/neutralna)

• Zastosowanie:

• Badanie genotoksyczności czynników

• Analiza systemów naprawy DNA

• Analiza chorób z uszkodzonymi systemami naprawy DNA

• Diagnoza prenatalna

• Terapia nowotworowa

• Elucja alkaliczna DNA przez filtry

Medium ze ekspozycja na Elucja przez filtry

Znakowaną tymidyną na czynnik węglowe; pH=12

Obecność naprawy DNA- dany czynnik wprowadza mutacje

• HPLC

• Detektory:

• Elektrochemiczne(uszkodzenia oksydacyjne, alkilowe pochodne)

• Fluorescencyjne(pochodne aflatoksyny B)

• Spektroskopia masowa - wszystkie uszkodzenia!

• Metody wykorzystujące przeciwciała

• Metoda kometowa

• γH2AX

• ELISA

• Niezaplanowana synteza DNA

H3 tymidyna po traktowaniu utrwalanie preparaty mikroskopowe pomiar emisji

Czynnikiem

Podczas naprawy wbudowana radioaktywna tymidyna(ocena poziomu syntezy DNA)

• Odmiana - Replikacyjna naprawa DNA

• Przed-znakowanie C¹⁴ lub P³²(znakowanie jednej nici)

• Ekspozycja na dany czynnik

• Inkubacja w medium z innymi znakowanymi pierwiastkami np. 5-bromodeoksyurydyną(radioaktywność nowo syntetyzowanej nici)

• Kolekcjonowanie

• Lizowanie

• Trawienie proteazami

• Pomiar aktywności

---