Mikroskopia elektronowa:

• Typy mikroskopów elektronowych:

- Transmisyjny

- Skaningowy

• Przygotowanie preparatu:

I. Pobieranie skrawków

• Małe wielkości tkanek

• Optymalna wielkość bloczka 1 mm³

• Pobrany preparat należy natychmiast utrwalić

II. Utrwalanie

1. etap utrwalania

• Aldehyd glutarowy - uniwersalny utrwalacz stosowany w obróbce przy technice mikroskopii elektronowej

• Aldehyd glutarowy + parafolmaldehyd w buforze o pH 7,4 - dodatkowo wzmacnia efekt utrwalania

2. etap utrwalania

• Utrwalanie preparatu w roztworze czterotlenku osmu.

III. Wypłukanie utrwalacza z tkanek z wykorzystaniem buforu o pH 7,4

IV. Przeprowadzenie wycinka przez szereg alkoholu o rosnącym stężeniu i roztworów tlenku propylenu w acetonie.

- Tlenek propylenu odwadnia tkanki mocniej niż aceton

- Dobrze łączy się z żywicą używaną do zatapiania

V. Po utrwaleniu skrawek zatapiamy z żywicy epoksydowej „Epon” (4-składnikowa)

- Polimeryzacja utwardza bloczek

- Przeprowadzana przez kilka dób w cieplarce w temperaturze 45 - 60° C

- Materiał jest również poczerniony

- Utrwalony materiał znajduje się na czubku preparatu

• Krojenie skrawków:

- Wstępnie preparat kroi się grube skrawki.

- Do krojenia grubych skrawków wykorzystuje się nóż szklany.

- Preparaty krojone są na ultramikrotonie.

- Skrawki są względnie niewielkie

• Grube skrawki o grubości 1,5 μ,

• Łapiemy je na szkiełko podstawowe na kroplę wody

• Grube skrawki barwi się błękitem metylenowym

• Widzimy je na szkiełku podstawowym jako niewielkie punkty

- Pod mikroskopem świetlnym poszukujemy elementów, które będziemy później obserwować w mikroskopie elektronowym.

• Uzyskanie mikroskrawków:

- Do krojenia cienkich skrawków wykorzystujemy nóż diamentowy

- Grubość noża diamentowego 2-3 mm

- Grubość cienkich skrawków 70 nm

- Skrawek powinien być jak najmniejszy

- Przed rozpoczęciem skrajania cienkich skrawków należy usunąć nadmiar i zbędnych fragmentów tkanki (przykład: w sytuacji kiedy mamy obejrzeć kłębuszek nerkowy wybieramy fragment tkanki w której on się znajduje, nadmiar usuwamy)

- Preparaty cienki podczas skrawania spływają do rynienki i znajdują się w wodzie.

• Mikroskrawki wyłapujemy na metalowe siateczki (np. niklowe) zawierające mikropory

• Preparat zawiesza się na mikrosiateczce

- Przed pierwszym użyciem mikrosiatki moczy się w etanolu, by je odtłuścić (na nieodtłuszczonych nie przylepiają się cienkie skrawki)

• Kontrastowanie mikrosiatek

- Wykorzystywane są sole metali ciężkich (duża liczba atomowa)

- Octan uranylu i cytrynian ołowiu

- Należy nakropić skrawki na siatce roztworem powyższych soli

• Próbki są gotowe do obejrzenia pod mikroskopem elektronowym

• Mikroskop elektronowy transmisyjny

- Kolumna w której jest wytworzona próżnia

- W górnej części drut wolframowy (katoda)

- Pod wpływem przyłożonego wysokiego napięcia (80kV) katoda emituje wiązkę elektronów, która ulega skupieniu, przechodzi przez kolumnę i preparat

• Powiększenie mikroskopu elektronowego: 3 000 - 250 000 X

• 2 etapy związane z wędrówką elektronów w trakcie obserwacji preparatu w mikroskopie elektronowym

I. etap - kondensacja elektronów w wiązkę

II. etap - powiększenie.

• Śluza - miejsce w którym umieszczamy preparat

• Próżnia w kolumnie - aby wiązka elektronów nie spaliła preparatu

• Długie oglądaniu preparatu w mikroskopie elektronowym prowadzi do zniszczenia próbki, stąd konieczność prowadzenia dokumentacji

• Wcześniej wizerunek preparatu utrwalano na kliszy fotograficznej obecnie z wykorzystaniem dołączonej kamery cyfrowej na dysku twardym komputera

• Gdy nie wykorzystywano kamer cyfrowych obraz oglądano na ekranie, zawierającym substancje fluorescencyjne znajdującym się na dole kolumny w ciemni

• Dołączona kamera cyfrowa ułatwia opracowanie zdjęć, Np. na przeprowadzenie pomiarów

• Obraz z mikroskopu elektronowego jest szaro - czarno - biały.
  

---