Ćwiczenie 1
Podstawowy sprzęt laboratoryjny; Zasady BHP; Obserwacja komórek zwierzęcych w mikroskopie świetlnym
Wymagane przygotowanie teoretyczne: ogólna budowa komórek prokariotycznych
i eukariotycznych, zadania.
1. Podstawowy sprzęt laboratoryjny - prezentacja
2. Opis komory Bürkera do liczenia komórek w zawiesinie (prezentacja komory)
3. Barwienie przyżyciowe komórek z hodowli (ćwiczenie wspólne dla całej grupy) częściowo wykonuje prowadzący.
Przygotowanie komórek (prowadzacy)
Komórki hodowane in vitro (ustalona linia komórkowa HCT 116) w butelce do hodowli, przylegające do podłoża. Hodowane w pożywce zawierającej wszystkie niezbędne składniki odżywcze (aminokwasy, witaminy, sole mineralne, glukoza) oraz 10% surowicy płodowej i gentamycynę (antybiotyk przeciwbakteryjny).
komórki zebrać z butelki hodowlanej za pomocą trypsynizacji (2x1,5 ml 0,1% r-ru
trypsyny i 0,05% EDTA w PBS) i przenieść do probówki 15ml
zneutralizować działanie trypsyny przez dodanie 3 ml podłoża do hodowli komórek
oszacować pod mikroskopem wymagane rozcieńczenie komórek
B. Barwienie i liczenie komórek w komorze Bürkera:
Pobrać z probówki z komórkami 30 μl zawiesiny komórek i przenieść do czystej probówki Eppendorfa, dodać 30 μl roztworu błękitu trypanowego wymieszać i nanieść do komory Bürkera z obu stron szkiełka nakrywkowego po 10 μl.
Liczyć pod mikroskopem komórki żywe (niewybarwione) i martwe (wybarwione) w 5 kwadratach każdej połowy komory (każdy kwadrat liczy inna osoba). Zapisać wynik.
Pobrać z probówki z komórkami 30 μl zawiesiny do nowej probówki i dodać 30 μl r-ru erytrozyny. Liczyć w komorze jak poprzednio.
Liczy się komórki w 5 zaznaczonych kwadratach w każdej z obu części komory
(czyli w 10 kwadratach).
Objętość 1 kwadratu = 0,1 mm3,
objętość 10 kwadratów to 1mm3 (1000 mm3 to 1 ml)
Suma komórek z 10 kwadratów x 1000 daje liczbę komórek w 1 ml badanej zawiesiny
4. Sprawozdanie:
Wstęp teoretyczny - opis komory Bürkera
Opis doświadczenia - przygotowanie komórek do liczenia w komorze
Wyniki - podać obliczoną ilość komórek żywych i martwych w każdym kwadracie, wyliczyć średnią oraz ilość komórek obu rodzajów na 1 ml zawiesiny dla dwóch barwników. Porównać wyniki odsetek komórek żywych i martwych dla dwóch barwników przyżyciowych.
Wnioski - zapisać, czy występują różnice w odsetku komórek martwych dla obu barwników. Jeśli tak, czym mogą być spowodowane.