Inżynieria genetyczna: techniki, osiągnięcia, problemy

Inżynierią genetyczną można określić postępowanie, które zmierza do określenia informacji genetycznej, wykorzystując w tym celu różne technologie.

Ogólne cele inżynierii genetycznej:

• modyfikacja DNA organizmów,

• wprowadzanie do DNA organizmów nowych genów,

• otrzymywanie dzięki ekspresji (uzewnętrznieniu informacji genetycznej zawartej w sekwencji nukleotydów) nowych genów wprowadzonych do DNA organizmów - nowych produktów.

Najważniejsze techniki inżynierii genetycznej:

• enzymy restrykcyjne - umożliwiają rozcinanie DNA w specyficznych miejscach za pomocą restrykcyjnych endonukleaz,

• klonowanie DNA - daje możliwość uzyskania specyficznych sekwencji DNA w dużych ilościach i niezmienionej formie,

• hybrydyzacja kwasów nukleinowych - umożliwia wykrycie z dużą dokładnością specyficznych sekwencji DNA i RNA,

• sekwencjonowanie DNA - umożliwia szybkie określenie sekwencji nukleotydów w najważniejszych genach,

• PCR - opracowanie łańcuchowej reakcji polimeryzacji DNA.

Najważniejszym przesłaniem inżynierii genetycznej jest ingerencja w materiał genetyczny. Przeważnie odnosi się to do jednego genu, którego trzeba zlokalizować i wyizolować, a następnie przenieść do komórek biorcy oraz umieścić nowy gen w odpowiednim miejscu DNA biorcy. Niezbędne jest do tego celu pofragmentowanie kwasu dezoksyrybonukleinowego.

Gdy dokonano odkrycia enzymów restrykcyjnych umożliwione zostało fragmentowanie DNA w odpowiednich miejscach oraz łączenie właściwych jego fragmentów. Restryktazy, bo również tak określa się te enzymy, wytwarzane są przez komórki bakteryjne, w celu ochrony ich przed przedostaniem się obcego DNA. Jedynym mankamentem jest fakt, że enzymy te rozpoznają i „tną” DNA o charakterystycznej dla nich sekwencji zasad (do 8 par nukleotydów, według innych źródeł do 23 par nukleotydów). Ponadto enzymy te mogą być stosowane do fragmentowania sekwencji polindromowych (sekwencje polindronowe oznaczają, że sekwencja jednej nici, jest taka sama, jak komplementarnej do niej nici drugiej, z tym, że czytanej w odwrotnym kierunku).

Enzymy restrykcyjne mogą zostawiać lepkie bądź tępe końce. Oznacza to w praktyce, że te pierwsze rozcinają DNA w taki sposób, że na obu jego końcach znajdują się odcinki o komplementarnych zasadach, to znaczy, że dzięki nim może dojść do połączenia pochodzących od różnych organizmów - fragmentów DNA. Restrykatazy pozostawiające tępe końce wykorzystywane są przeważnie do rozcinania w wybranych miejscach DNA, ponieważ nie nadają się do łączenia pofragmentowanych odcinków kwasu dezoksyrybonukleinowego..

W celu połączenia różnych odcinków DNA niezbędne jest zastosowanie ligaz (enzymów przyczyniających się do powstawania nowych wiązań i wydzielających równocześnie pirofosforan). Od nazwy tych enzymów proces polegający na odtworzenie struktury DNA nazywany jest ligacją.

Powielanie odcinków DNA, w których zyskuje się jego identyczne kopie można przeprowadzić poprzez klonowanie DNA (in vivo). Metoda ta polega na wprowadzeniu genu (wcześniej wyselekcjonowanego) do komórki żywej, która przez swój podział powoduje zwiększenie ilości komórek potomnych i tym samym - genu, który został do niego wprowadzony. Drugi sposób to wykorzystanie reakcji łańcuchowej polimerazy (in vitro). Technika ta określana, jako PCR daje możliwość uzyskania kopii DNA. Polega ona na rozdzieleniu odpowiedniego fragmentu DNA, przy zastosowaniu podwyższonej temperatury, następnie jej obniżeniu i dołączeniu do oddzielonych nici starterów (zsyntetyzowanych w warunkach sztucznych), oraz w celu replikacji na dodaniu polimerazy DNA (enzymu odpowiedzialnego za syntezę).

Jeżeli gen jest już wyizolowany i „skopiowany” to należy go przenieść do komórek biorcy, np. przy użyciu plazmidów lub bakteriofagów. Nazywane są one wektorami. Zarówno jedne jak i drugie występują w niektórych bakteriach. Plazmidy to cząsteczki DNA, które posiadają zdolność do ulegania replikacji w bakteryjnych komórkach. Przez proces zwany transformacją, można je izolować z jednych komórek bakteryjnych do innych poprzez zwiększenie przepuszczalności ściany bakteryjnej tzn. po jej osłabieniu staje się przepuszczalna dla plazmidowego DNA. Do tych wektorów wstawia się fragmenty DNA, o odpowiedniej sekwencji. Po zrekombinowaniu DNA namnaża się go między innymi w Eschericha coli.

Aby inżynieria genetyczna działała prężnie musi dysponować kopiami genów wszystkich gatunków. Jest to rzecz trudna do zrobienia, ale efekty można uzyskać poprzez tzw. banki genów, czy biblioteki cDNA. Banki genów zawierają kopie określonych fragmentów kwasu dezoksyrybonukleinowego wraz z wektorami. cDNA to dwuniciowa cząsteczka, która zostaje uzyskana poprzez odwrotną transkrypcje mRNA. cDNA jest w stosunku do mRNA komplementarny.

Jedną z najczęściej stosowanych metod pozwalających na wykrycie pożądanego DNA jest metoda wykorzystujące sondy genetyczne. Sondę genetyczną stanowi przeważnie radioaktywny fragment kwasu rybonukleinowego, albo kwasu dezoksyrybonukleinowego, jednoniciowego o sekwencji zasad, która jest komplementarna w stosunku do nici genu pożądanego. Sonda genetyczna powoduje hybrydyzację, czyli ulega łączeniu z DNA, w taki sposób, aby utworzyć komplementarne pary zasad. DNA, który jest zawarty w komórkach w postaci kolonii, staje się radioaktywny. Komórki pochodzące z takiej kolonii hodować można na dużą skalę. Konkludując przy użyciu sond genetycznych można wykryć specyficzną sekwencję DNA.

Po sklonowaniu właściwego fragmentu DNA należy przeprowadzić jego analizę poprzez przygotowanie mapy miejsc, w których DNA zostało pofrgamnetowane, a następnie należy dokonać sekwnecjonoania kwasu dezoksyrubonukleinowego. Mapa taka pomocna jest przy otrzymywaniu fragmentów DNA, ale znacznie mniejszych. Polega to na tym, że DNA przy pomocy restrykcyjnych enzymów zostaje przecięte, a odcinki DNA, które w ten sposób powstają, rozdziela się za pomocą żelowej elektroforezy. Elektroforezę stosuję się, w celu zidentyfikowania masy cząsteczkowej poszczególnych fragmentów. Należy jeszcze określić ich długość, po czym pozycję i ich wzajemną odległość.

Sekwencjonowania dokonuje się przy użyciu polimerazy. Kopiowanie nici klonowanego uprzednio materiału genetycznego przebiega w czterech mieszaninach reakcyjnych równocześnie. Bardzo ważnym jest, aby proces syntetyzowania nowej nici zakończył się w miejscu występowania zasady należącej do tego samego rodzaju, ale różnego w każdej z tych mieszanin. Sekwencje zasad sklonowanego DNA uzyskuje się za pomocą obrazu, powstałego dzięki elektroforezie żelowej. Pozwala to na poznanie sekwencji cząsteczek DNA kodujących białek oraz sekwencji wpływających na ekspresję genu.

Można również posłużyć się hybrydyzacją Southerna. Sklonowane geny i pofragmentowane przy użyciu endonukleaz, po oznaczeniu atomami o działaniu radioaktywnym, mogą być wykorzystywane do wykrywania z innych komórek DNA i RNA o pokrewnych sekwencjach. Badany kwas dezoksyrybonukleinowy zostaje poddany podobnie jak opisano wcześniej działaniu endonukleaz restrykcyjnych, a powstałe w wyniku tego fragmenty pod wpływem elekrtoferazy ulegają oddzieleniu. Następnie stosuje się barwienie, w wyniku, którego na żelu elektroferazowym uwidaczniają się prążki, zawierające fragmenty DNA o odpowiedniej długości. W etapie następnym te oddzielone fragmenty materiału genetycznego wiąże się z filtrem. Filtr może być wykonany z nitrocelulozy, bądź nylonowej błony. W filtr ten wsiąka żel, zawierający DNA. Poprzez inkubację filtru dochodzi do związania się fragmentów sklonowanych genów oznakowanych atomami radioaktywnymi z fragmentami, które posiadają komplementarne do nich sekwencje.

Enzymy restrykcyjne wykorzystuje się również do określania polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych. Mutacje i rekombinacje materiału genetycznego powodują zróżnicowanie liczby i usytuowania miejsc przecinanych przez odpowiednie restryktazy. W związku z tym zróżnicowane są również długości fragmentów rozcinanych. Jest to nazywane polimorfizmem długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP).

Uzyskanie i zobaczenie DNA

I sposób:

1. DNA znajduje się w każdej komórce, a dokładnie w jej jądrze komórkowym,

2. Zniszczenie otoczki komórkowej, w celu podjęcia działań zmierzających do wyciągnięcia DNA

3. Rozdrobnienie materiału źródłowego, z którego pozyskane zostanie DNA (np. przy użyciu piasku o małej wielkości ziaren, miksera, wyciskarki, maszynek służących do mielenia itp.). Im większe rozdrobnienie tym lepiej, ponieważ więcej komórek oddzielonych zostanie od tkankowej struktury (jednolitej) i tym więcej zostanie uzyskanego w późniejszym etapie materiału genetycznego

4. Dodanie do rozdrobnionego materiału wody, (jeżeli posiada zbyt małą wilgotność),

5. Rozdrobnienie materiału na kawałki i poddanie go pod działanie buforu, w celu jak największego ograniczenia degradacji kwasu dezoksyrybonukleinowego,

6. Doprowadzenie do rozerwania ściany komórkowej, przy zastosowaniu detergentów, (detergenty, czyli inaczej środki czyszczące powszechnie stosowane w gospodarstwach domowych, wykazują charakterystyczne dla siebie właściwości, gdyż posiadają dwie specyficzne grupy funkcyjne: grupę hydrofilową, wykazującą powinowactwo do wody, oraz grupę hydrofobową, tego powinowactwa nie wykazującą. Białka i fosfolipidy to czynniki budulcowe błon komórkowych. Jeśli błony komórkowe podda się działaniu detergentu, to zniszczeniu ulegną wszystkie części tłuszczowe, które w tej błonie się znajdowały. Ponadto detergenty działają degradująco na białka, powodując rozbicie ich dużych struktur i powstawanie mniejszych, a że materiał genetyczny jest związany z białkami, to po zastosowaniu detergentu zostanie on z nich oczyszczony),

7. Przedostanie się części molekularnej do buforu (bufor: detergent 10 ml, detergent powinien zawierać jak najmniej domieszek tzn. środków barwiących i zapachowych, soda oczyszczona 5 g, sól kuchenna 1,5 g, woda destylowana, nie zawierającą jonów wapniowych i magnezowych - dopełnienie do 100 ml, powolne mieszanie, by nie doprowadzić do zapienienia, schładzanie najlepiej w lodówce, a przy wykonywaniu dalszych czynności, aby zapobiec degradacji materiału genetycznego, wystarczy umieścić bufor w większym pojemniku z lodem),

8. Poddanie działaniu buforu (10 ml), wcześniej otrzymanej substancji, czyli rozdrobnionego materiału z wodą (5 ml),

9. Mieszanie (3 minuty),

10. Ogrzewanie (10 minut - dłuższy czas ogrzewania mogłoby spowodować degradację DNA, a wskutek oddziaływania detergentu błony komórkowe ulegają rozpadowi, na skutek rozkładu cząstek lipidowych w nich zawartych, temperatura: 60°C), DNA przedostaje się do roztworu.

11. Uwolnieniu ulegają lipidy oraz białka, pozostawiając DNA, wskutek działania detergentów i temperatury,

12. Schładzanie roztworu, (5 min.)

13. Oddzielenie elementów organicznych znajdujących się w roztworze, (do tego celu można posłużyć się np. filtrami do kawy, proces wlewania powinien być tak przeprowadzony, aby na filtrze nie znalazła się piana, można użyć również mikrowirówki) oraz odlanie czystego roztworu (5 ml),

14. Umieszczenie na powierzchni roztworu izopropanolu (10 ml), (najlepiej bez żadnych dotykowych substancji ani barwiących, ani zapachowych, o dużym stężeniu), schłodzony izopropanol, przelewa się do roztworu po ściance naczyńka, w którym roztwór się znajduje, powoli, aby pozwolić na rozgraniczenie buforu i izopropanolu, ten pierwszy, bardziej gęsty pozostanie na dnie, natomiast izopropanol o mniejszej gęstości będzie utrzymywał się na górze,

15. Wyciągnięcie za pomocą np. pałeczki, lub innych przyrządów z zakrzywionym końcem, DNA z roztworu (dłuższych nici, jeżeli DNA nie uległo zdegradowaniu), wyciąganie polega na umieszczeniu przyrządu w buforze, przez delikatne włożenie go, do izopropanolu, następnie na obracaniu i na zmianę na przesuwanie w dół i w górę, w wyniku tej czynności dłuższe odcinki DNA, jeśli tylko znajdują się w roztworze powinny nawiną cię na przyrząd,

16. Umieszczenie wyciągniętych nici w buforze, nie zawierającym detergentu, co umożliwia oglądanie kwasu dezoksyrybonukleinowego,

17. Zastosowanie barwników (błękitu metylenowego, zieleni malachitowej), w celu zobaczenia pozostałych w roztworze krótkich nici DNA.

II sposób:

1. Bufor: sól (pół łyżeczki), detergent (10 ml), woda destylowana (100 ml),

2. Materiał - komórki pochodzące z wewnętrznej strony jamy ustnej (policzków), aby uzyskać materiał wewnętrzną stronę policzków należy potrzeć wacikami, przygotowanymi specjalnie do tego celu, analizie zostaną poddane komórki, które na waciku takiego patyczku się znajdą, jako przyrząd zastępczy można wykorzystać patyczki do uszu, ale powinny być one sterylne,

3. Po potarciu patyczkami wewnętrznej strony jamy ustnej, zanurzyć należy taki patyczek w wodzie destylowanej, oraz uderzać nim, aby jak najwięcej pobranych komórek znalazło się w tej wodzie,

4. Wypłukanie jamy ustnej wodą destylowana, po dwukrotnym wypłukiwaniu należy dodać do wody destylowanej buforu (1 ml), wcześniej schłodzonego; można zastosować albo punkt trzeci albo punkt czwarty,

5. Mieszanie, w taki sposób, aby nie doszło do zapienienia,

6. Gotowanie wody (2 min.), w celu spowodowania wypłynięcia z komórek materiału genetycznego, ale również wypłynięciu mogą ulec inne składniki komórki,

7. Schłodzenie roztworu,

8. Oddzielenie materiału genetycznego od innych składników komórki, które również zostały uwolnione, przy zastosowaniu np. mikrowirówek, otrzymaną w ten sposób próbkę, która może być przechowywana w lodzie,

9. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej mix PCR

10. Do próbówek zawierających reakcyjną mieszaninę dodanie roztworu DNA, jedną próbkę pozostawia się czystą, to znaczy zawiera ona sam PCR mix, bez dodatku kwasu dezoksyrybonukleinowego, w celu późniejszej weryfikacji, czy analiza nie została zanieczyszczona innym materiałem genetycznym,

11. Do przenoszenia próbek można używać łaźni wodnej,

12. Poddanie roztworu wysokiej temperaturze (ok. 95°C, 1 min.), co powoduje rozdzielenie materiału genetycznego,

13. Rozwinięcie i rozdzielenie na poszczególne nici, podwójnej helisy, z której zbudowane jest DNA,

14. Zamykanie próbek, aby ze względu na podwyższoną temperaturę zbytnio nie parowały,

15. Obniżenie temperatury do 60°C (1,5 min.), a następnie podniesienie jej do ok. 70°C (1,5 min.),

16. Powtarzanie czynności trzydzieści razy,

17. Uzyskanie - w wyniku polimeryzacji reakcji łańcuchowej - zwiększonej ilości materiału genetycznego,

18. Większa ilość materiału genetycznego powinna znajdować się w próbkach, z wyjątkiem próbki kontrolnej.

Zastosowanie inżynierii genetycznej:

• Likwidacja zanieczyszczeń powodowanych przez wycieki ropne z tankowców oraz inne zanieczyszczenie (np. siarką), dzięki nowym gatunkom bakterii i grzybów, wykazujących zdolności do ich rozkładania,

• Identyfikacja sekwencji DNA, która związana jest z określonymi wadami o podłożu genetycznym (sondy radioaktywne).

• Określenie stopnia pokrewieństwa genetycznego, ustalanie ojcostwa, macierzyństwa, identyfikacja osób w kryminalistyce (polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych),

• Insulina ludzka produkowana w Eschericha coli (wytwarzanie białka ludzkiego, przy użyciu sztucznej rekombinacji kwasu dezoksyrybonukleinowego),

• Produkcja ludzkiego hormonu wzrostu (sztuczna rekombinacja DNA),

• Produkcja czynnika białkowego krzepnięcia krwi (sztuczna rekombinacja DNA),

• Transgeniczne organizmy:

• Zwierzęta:

• Transgeniczne myszy (zawierające gen białka, które powoduje rozpuszczanie skrzepów krwi, doprowadzających do zawału serca),

• Transgeniczne owce (dają mleko zawierające ludzki czynnik krzepnięcia krwi),

• Rośliny:

• Transgeniczna bawełna ( zawiera domieszkę poliestru),

• Transgeniczne pomidory (charakteryzujące się przedłużoną trwałością w warunkach przechowalniczych),

• Transgeniczny tytoń (odporny na herbicydy),

• Transgeniczne ziemniaki (produkujące białko, które w ludzkim organizmie jest odpowiedzialne za odpowiednie ciśnienie krwi),

• Hodowla organizmów transgenicznych, jako dawców organów dla ludzi,

• Udoskonalanie metod i technik produkcji i zwiększenia trwałości żywności,

• Ratowanie zagrożonych wyginięciem gatunków zwierząt (przez ich klonowanie).

To tylko kilka przykładowych zastosowań inżynierii genetycznej. Niektóre z nich budzą wiele kontrowersji, jak wszystko nowo odkryte, nie do końca poznane i niezupełnie rozumiane przez ogół społeczeństwa. Największe kontrowersje budzi ingerencja w ludzki materiał genetyczny, oraz aspekty moralno-etyczne na przykład przeszczepów organów zwierzęcych do organizmu ludzkiego.

W inżynierii genetycznej pokładanych jest wiele nadzieje, wynikających z jej zastosowania, a więc po pierwsze szerokie możliwości leczenia ludzi nowymi, szybszymi sposobami, oraz leczenie chorób, na które medycyna do tej pory nie znała lekarstwa. Inżynieria genetyczna zmierza również do ulepszenia produkcji żywności, zwiększenia jej trwałości, większej odporności na szkodniki i choroby, i być może, wskutek zwiększającej się liczby ludności i coraz mniejszej zdolności produkcyjnej gleb, zlikwiduje to trwający obecnie i być może zwiększający się w przyszłości problem głodu.

Niestety z inżynierią genetyczną wiąże się tez pewne obawy ze strony społeczeństwa, oraz te natury technicznej, do rozwiania, których dążą genetycy.

Problemy inżynierii genetycznej:

• Organizmy prokariotyczne i ekuariotyczne mają różną organizację materiału genetycznego, a więc jeśli umieści się gen organizmu eukariotycznego w organizmie prokariotycznym, to efekt nie będzie odzwierciedlał prawdy. Problem ten wynika z fakty, że organizmy prokariotyczne niestety nie posiadają enzymów służących do łączenia egzonów (geny zawierające sekwencję kodującą) i wycinania intronów (geny zawierające sekwencję niekodującą), ale posiadają geny, o sekwencji ciągłej,

• Nie możliwość użycia bezpośredniego fagów, jako wektorów, gdyż komórka roślinna zawiera ścianę komórkową. Obecnie, aby do komórek roślinnych wprowadzić inny materiał genetyczny stosuje się tzw. armatki genetyczne. Metoda ta jest niezwykle prosta, a polega na tym, że na cząstki metalu mikroskopijnych wielkości nanosi się materiał genetyczny, które chce się przenieść do komórki roślinnej. Cząstki DNA z tym metalem zostają wstrzelone do komórki z dużą prędkością, co powoduje przebicie owej ściany komórkowej i przedostanie się DNA do jądra komórkowego,

• Problemem, z którym boryka się inżynieria genetyczna jest stosunkowo mała pojemność stosowanych wektorów. Plazmidy mogą pomieścić DNA, długości 1000 par zasad azotowych. Wektory fagowe mieszczą znaczniej więcej, bo 15 tysięcy par zasad, ale z kolei geny pochodzące od organizmów eukariotycznych są o wiele większe, więc w takich przypadkach stosuje się na przykład opisane powyżej armatki genetyczne,

• Konieczność neutralizowania organizmów wykorzystywanych jako wektory. Aby wirus, który jest wektorem, nie powodował infekcji, musi zostać rozbrojony, to znaczy, że jego geny, które mogą wywołać infekcje, bądź jakiekolwiek inne niepożądane efekty, muszą zostać zlikwidowane, albo unieszkodliwione.

To tylko kilka problemów natury czysto technicznej, z którymi muszą uporać się naukowcy zajmujący się inżynierią genetyczną. Oprócz tego typu problemów, ze strony społeczeństwa istnieje szereg obaw. Są to obawy natury: społecznej, moralnej, etycznej, religijnej, ekonomicznej….Obawy o podtekście społecznym to pytania, na ile inżynieria genetyczna, jako nauka i badania przez nią prowadzone przyniesie korzyść ludzkości. Moralno-etyczne obawy budzą najwięcej kontrowersji, Dotyczą przede wszystkim samego faktu ingerencji w materiał ludzki, co w zasadzie można porównać do sprzeciwianiu się operacjom serca i transplantacji organów, gdy zabiegi te były jeszcze mało poznane. Protesty odnoszą się do klonowania, jako procesy sprzecznego z naturą ludzką (za sprzeczne z nią można by również w takim razie zaliczyć, udawanie się do lekarza, branie tabletek, zabiegi itp.). Obawy o treści religijnej odnoszą się do procesu klonowania. Do tej pory naukowcom udało się dokonać sklonowania zwierząt, do sklonowania człowieka jeszcze nie doszło. Należy zaznaczyć, że w wyniku klonowania, uzyskiwany jest jedynie taki sam organizm, a nie ma to żadnego wpływu na „duszę”. W końcu obawy o podtekście ekonomicznym, to pytania na ile to wszystko jest opłacalne…. Ale chyba każdy się zgodzi, że nie można podać odpowiedniej ceny za ludzkie życie….

Bibliografia:

1. Solomon, Berg, Martin, Villee. Biologia. Mulitico Oficyna Wydawnicza. Warszawa 1996.

2. W. Lewiński. Genetyka. Wydawnictwo „Operon”. Koszalin 1998.

Zgodnie z regulaminem serwisu www.bryk.pl prawa autorskie do niniejszego materiału posiada Wydawnictwo GREG. W związku z tym, rozpowszechnianie niniejszego materiału w wersji oryginalnej albo w postaci opracowania, utrwalanie lub kopiowanie materiału w celu rozpowszechnienia w szczególności zamieszczanie na innym serwerze, przekazywanie drogą elektroniczną i wykorzystywanie materiału w inny sposób niż dla celów własnej edukacji bez zgody Wydawnictwa GREG podlega grzywnie, karze ograniczenia wolności lub pozbawienia wolności.

---