Co to są przeciwciała?
To rozpuszczalne białka syntetyzowane przez organizmy w odpowiedzi na pojawienie się obcej substancji. Mają swoiste powinowactwo do antygenu.
Wymień klasy immunoglobulin i podaj ich zasadnicze funkcje:
IgG - najważniejsza w organizmie, decyduje o ukł. odpornościowym
IgM - wczesne przeciwciała - pierwsza linia obrony przeciw obcym drobnoustrojom w organizmie
IgA - ochrona błon śluzowych
IgD - ma wpływ na funkcje limfatyczne
IgE - ochrona przeciwko pasożytom jelitowym, odpowiedzialna także za różne objawy alergii.
Która z immunoglobulin wytwarza przeciwciała przeciwko bakteriom, wirusom i grzybom?
IgG
Co to jest koniugat?
Przeciwciało znakowane enzymem np. fosfatazą alkaliczną.
Co to jest okienko serologiczne?
Czas od chwili zakażenia do wytworzenia się przeciwciał zwalczających dany antygen.
Wymień odczynniki niezbędne do przeprowadzenia testu ELISA?
1. Substrat -p- nitrofenylofosfat- związek chemiczny o bezbarwnych cząsteczkach, a przy zetknięciu z fosfatazą alkaliczna powoduje reakcję barwną
2. Bufory:
a) powlekający do rozcieńczenia IgG pH 9,6 (węglan sodu, kwaśny węglan sodu, azydek sodu)
b) PBS-T - do płukania pH 7,4
c) PBS-T - do płukania próbek i koniugatu (albumina, PVP)
d) bufor substratowy pH 9,6
Co to jest antygen?
Może być każda obca substancja w organizmie, która wykazuje dwie cechy: *immunogenność, czyli zdolność wzbudzenia przeciwko sobie odpowiedzi odpornościowej swoistej,
*antygenowość- czyli zdolność do reagowania z przeciwciałami, mogą to być białka, polisacharydy, nukleiny.
(obca cząst. w organ. zdolna do wywołania syntezy przeciwciał.)
Jaki enzym stosujemy w teście ELISA?
Fosfataza alkaliczna
Na czym polega ostatni, czwarty etap w teście ELISA?
Polega na nanoszeniu roztworu substratu, inkubowaniu go przez jedną godzinę w temp. pokojowej a kończy się oceną wizualną.
Podaj przykłady roślin produkujących przeciwciała?
Nie ma takich roślin !!! bo nic produkują
Wymień zalety testu ELISA.
- wysoka czułość metody
- możliwość badania wszystkich część roślin
- uniwersalna w zastosowaniu
- wczesne uzyskiwanie wyniku badań
Na czym polega liza komórek?
Na mechanicznym uszkodzeniu np. *poprzez ucieranie tkanek w ciekłym azocie *traktowanie chemiczne *trawienie enzymatyczne.
Jest to 1 etap izolacji DNA , zapewnia uwolnienie DNA z komórek do buforu ekstrakcyjnego.
Jaką rolę spełnia detergent w procesie izolacji DNA?
Służy do oczyszczenia materiału z jakiego będzie izolowane DNA. Tworzy środowisko reakcji. Ma zdolność wiązania cząsteczek lipidów.
Pomiar ilości DNA dokonujemy metodą spektrofotometryczną przy długości fali 260 nm.
W jaki sposób oznaczamy zanieczyszczenie DNA metodą spektrofotometryczną?
Dzieląc wynik ilości DNA uzyskany przy długości fali 260nm przez wynik obecności białek w roztworze uzyskany przy dł. fali 280nm. Wartość ta mówi o czystości próby:
< 1.5 - zanieczyszczona białkami,
1,5 - 1,8 - czysta,
>1,8 - zanieczyszczona odczynnikami
Jakie znasz różnice pomiędzy genomem roślin wyższych a genomem grzybów?
Różnica w liczbie chromosomów.
Wymień co najmniej dwie przyczyny trudności związanych z izolacją DNA z grzybów.
- zbyt gruba i ścisła ściana komórkowa - za mało materiału DNA zostało wyizolowane
- niewielki rozmiar genomu grzyba
- zanieczyszczenia materiału DNA odczynnikami
- zanieczyszczenie materiału białkiem grzybów.
W jaki sposób następuje oczyszczanie DNA w procesie izolacji?
1. zastosowanie CTAB - mieszanina oktanolu i chloroformu - usunięcie białek
2. zastosowanie minikolumn - kilkakrotne płukanie alkoholem menbran silikonowych z materiałem DNA.
3. zastosowanie alkoholu- wytrącanie DNA podczas gdy detergent zostanie usunięty z alkoholem.
Co to są nukleazy i jakie znasz sposoby ich dezaktywacji?
Nukleazy są to enzymy, rozkładające DNA naturalnie wyst. w komórkach, których funkcją jest obrona przed wirusami, ich dezaktywacja następuje poprzez dodanie EDTA do roztworu lub zastosowanie wysokich temperatur(denaturacja, 90-92ºC).
Podaj przykłady chorób roślin i patogenów, w przypadku których diagnostyka PCR ma szczególne uzasadnienie. Uzasadnij konieczność stosowania analiz PCR w diagnostyce wymienionych patogenów roślin.
* Łamliwość źdźbła zbóż - Tapesia acuformis (typ R) i Tapesia yallundae (typ W) zastosowanie PCR pozawala odróżnić patogena powodującego chorobę oraz zastosować odpowiedni środek ochrony, gdyż te dwa patogeny wymagają odmiennego sposobu zwalczania.
* Septorioza paskowana liści - Septoria Tritici - ostatnio pojawiające się mutacje w genach patogena wymagają poszukiwania nowych środków ochronnych, co wymaga zbadania dokładnego DNA patogena.
Wymień etapy reakcji PCR.
1. Denaturacja cieplna matrycy DNA (90-94 °C) - rozerwanie podwójnej nici DNA na 2 pojedyncze
2. Przyłączanie primerów do matrycowego DNA (55- 68 °C)
3. Synteza nowej nici DNA. Zaczyna się od końców 3'przyłączonych primerów i jest katalizowana przez polimerazę DNA. Tak więc w wyniku reakcji zostaje powielony fragment DNA zawierający się pomiędzy polimerazami (72°C)
Powtarza się te etapy cyklicznie 25-40 razy.
Wymień komponenty reakcji PCR.
1. matryca DNA(frag DNA który zostanie powielony)
2. bufor reakcyjny: 50 ml KCL, 10 mM Tris - HCL
3. nukleotydy dATP, dCTP. dGTP, dTTP
4. MgCl2
5. pollimeraza DNA
6. primery (startery, około 20 nukleotydowe odcinki DNA których sekwencja jest kamplementarna do matrycowego DNA)
7. H2O (środowisko reakcji)
Podaj przykłady metod PCR stosowanych w badaniach zmienności genetycznej populacji grzybów chorobotwórczych:
1. SCAR- zastosowanie specyficznych gatunkowo starterów dla różnych gatunków
2. RAPD- zastosowanie jednego, losowo wybranego primera (10par zasad) który może przyłączyc się w kilku losowych miejscach
3. AFLP- DNA jest cięte enzymami restrykcyjnymi. Nastepnie dołączają się adaptory do końcow fragmentów. Następnie jest reakcja PCR (elektroforeza)
4. BIO-PCR- fragmenty roślin lub ziarno wykłada się na pożywki i hoduje 24-48godzin. Izoluje się tylko z żywych kom. Stosowany dla wykluczenia fałszywych wyników.
5. PCR-RFLP- jest techniką w której organizmy mogą być różnicowane poprzez analizę wzorów pochodzących z pocięcia ich DNA
Wymień inhibitory reakcji PCR?
Zw. Fenolowe, polisacharydy, białka i kw. humusowe
Na czym polega metoda BIO-PCR?
Polega na wykrywaniu mikroorganizmów chorobotwórczych tylko z żywych komórek patogena.
Co to są mykotoksyny? Podaj przykłady mykotoksyn fuzaryjnych i gatunków je syntetyzujących.
Mykotoksyny są to wtórne metabolity grzybów powstające tam gdzie ma miejsce rozwój gatunków toksynotwórczych.
Mykotoksyny fuzaryjne:
1. deoksynivalenol, nivalenol, zearalenol - Fusarium graminearum
2. moniliformina, enniatyna - Fusarium avenaceum
3. trichoteceny - Fusarium sporotrichoides
Produkt reakcji PCR po procesie elektroforezy na żelu agarozowym porównujemy do wzorca masy molekularnej DNA danego gatunku.
Na czym polega diagnostyka PCR poszczególnych chemotypów grzybów z rodzaju Fusarium?
……..
Metoda tradycyjna diagnostyki patogenów grzybowych polega na
Hodowli testowanego materiału w warunkach laboratoryjnych na odpowiedniej pożywce a następnie wizualnej ocenie otrzymanych mikroorganizmów pod mikroskopem
natomiast czynnikiem na podstawie którego następuje wykrycie/identyfikacja patogenu metodą PCR Jest wyizolowanie DNA tego patogena i jego zbadanie.
Dlaczego w reakcji SCAR-PCR następuje specyficzna amplifikacja fragmentu DNA patogenu?
Dlatego ze stosuje się specyficzne gatunkowo starterv. które działają tylko w obecności wymagane gogenomu patogena.
Wymień etapy składające się na proces diagnostyki molekularnej chorób grzybowych roślin:
1. wyodrębnienie i oczyszczenie materiału roślinnego zawierającego patogena.
2. wyodrębnienie i oczyszczenie materiału DNA
3. wymagany proces powielenia DNA.
4. porównanie do wzorca DNA
5. odczytanie wyników i rozpoznanie patogena
Wymień pożywki stosowane w badaniach mikrobiologicznych?
1. organiczna PDA - bogata, szybki wzrost: ziemniak, agar, sacharoza lub glukoza. Czasami zakwaszana aby ograniczyć rozwój bakterii.
2. syntetyczna- skład jest w całości znany, nie daje koloru grzybom ( SNA, kwaśna, czapka)
3. półsyntetyczna- czapka z ekstraktem drożdży, jest jeden składnik o nieznanym składzie
Podaj przykłady gatunków grzybów patogenicznych omawianych na ćwiczeniach?
Fusarium poae, avenaceum, culmorum, graminearum, sporotrichioides, Botrytis cinereae, Botrytis ssp., Ascochyta pisi
Wymień charakterystyczne cechy morfologiczne grzybów na podstawie których przeprowadza się identyfikacją mikroskopową?
Zarodniki, grzybnia, strzępka, fialidia, pinnota, chlamydospora, sporodochium, kolor na pożywce, piknidia, acerwulusy, przycistki, skleroty.
Podaj jednostki w jakich mierzona jest fotosynteza za pomocą aparatu LI-COR 6400
Zużycie CO2 w milimolach na 1 cm2 * 1s.
Wymień czynniki warunkujące wzrost grzybów patogenicznych w warunkach laboratoryjnych:
- pożywka PDA
- Optymalna temperatura 18-24 o C
- 12 h ciemności + 12h UV
- O2 dla niektórych gatunków jest istotny
Za pomocą jakich wiązań połączone są ze sobą nukleotydy w DNA:
- za pomocą wiązań fosfodiestrowych (kowalencyjnych)
Zasada azotowa z cukrem pentozą w DNA połączone są za pośrednictwem
- silnego wiązania kowalencyjnego N-glikozydowego.
Jaki ładunek ma DNA.
- Ujemny
DNA komórkowe zlokalizowane jest:
a) u grzybów: 90% jądro komórkowe, 10% mitochondria
b) u roślin - jądro komórkowe, mitochondria, chloroplasty.
W jakim celu stosuje się EDTA podczas izolacji DNA:
Chroni DNA przed działaniem nukleaz (chelatuje Mg 2+ i nukleazy są nieaktywne)
Pomiar DNA w spektrofotometrze dokonuje się przy długości fali:
a) ilość: 260 nm
b) czystość: 260 nm i 280 nm.
Zjawisko interkalacji polega na:
- wbudowaniu bromku etydyny w cząsteczke DNA pomiędzy pary zasad dzięki czemu na żelu agarozowym świeci pod wpływem UV.
Jakiego rodzaju żel stosujemy w elektroforezie:
- Najlepsze są żele nisko procentowe ( zawierające 0,8-1% agarowy)
Do izolacji DNA używamy:
- Detergent (np. CTAB)- niszczy błony komórkowe
- PVP. Wiąże związki fenolowe,
- EDTA (związek chelatujący) - chroni DNA przed działaniem nukleaz
- NaCl- zwiększa rozpuszczalność DNA w roztworze
- B - Mercaptoetanol- zapobiega utlenianiu DNA
Do oceny produktów PCR używamy:
- wzorca masy molekularnej DNA
Uzupełnij sekwencje wg komplementarności:
- Adenina = tymina (A=T)
- Guanina = Cytozyna ( G=C) - łatwe do rozerwania
- sekwencje zapisuje się zawsze od końca 5' do 3'
W jakiej temp. Zachodzi synteza nici DNA w reakcji PCR:
- synteza 68 - 72 oC
- hybrydyzacja polimerów - 40-60 oC
Startery (primery) to :
-krótkie odcinki DNA ok. 20 nukleotydów,
Produkt reakcji PCR porównujemy do
Wzorca masy molekularnej DNA.
DNA składa się z :
Zasady azotowe [purynowe (A,G) pirymidynowe (C,T) + cukier pentoza= nukleozyd, Nukleozyd + reszta kw. fosforowego= nukleotyd
Etapy izolacji DNA:
- liza komórek,
- zablokowanie działania nukleaz (inaktywacja),
- oczyszczenie DNA,
Synteza nowej nici DNA w reakcji PCR rozpoczyna się od:
- Rozerwanie wiązań wodorowych, po czym powstają z jednej podwójnej nici dwie pojedyncze. Do każdej z nich przyłącza się jeden primer i na końcu każdego primera polimeraza dobudowuje nić i w ten sposób powstają dwie podwójne nici.
Przeciwciała lub cząsteczka immunoglobuliny składa się z:
- 2 łańcuchy lekkie
- 2 łańcuchy ciężkie
- zawiasy,
- miejsca wiążące antygen.
Jaką funkcję pełnią przeciwciała?
-Rozpoznają swój antygen i z wysoką swoistością wiążą go.
Co wykrywa test ELISA?
- wykrywa obecność i stężenie przeciwciał dzięki barwnej reakcji z antygenami. Metoda ta jest tylko dla wirusów i bakterii.
Ile miejsc wiążących posiada przeciwciało ? DWA
Co stanowi wzorzec negatywny w teście ELISA?
-sok zdrowej rośliny
Jaką role odgrywa enzym w teście ELISA?
- Znakowane jest nim przeciwciało.
Jakie enzymy występują w teście ELISA?
-fosfataza alkaliczna
Jaką rolę pełni substrat w teście ELISSA?
- Przy zetknięciu z fosfatazą alkaliczną powoduje reakcje barwna.
Jakie parametry wymiany gazowej mierzy się za pomocą Li COR 6400:
-Intensywność fotosyntezy.
W jakich jednostkach mierzy się natężenie fotosyntezy? µmol CO2m-2s-1
Jakich odczynników używa się do pomiaru intensywności fotosyntezy?
Desykant, soda i inne
Jaka jest długość fali w teście ELISSA?
-405 nm
Jaki enzym jest w reakcji PCR?
- polimeraza DNA.
Jaką role w rekacji PCR pełni enzym Tag Polimeraza?
- inicjuje wydłużanie primerów.
Diagnostyka- jest ściśle związana z symptomatologią, czyli nauką o objawach chorobowych roślin.
Choroba - Długotrwałe zakłócenie funkcji fizjologicznych roślin, które uniemożliwaija normalny ich rozwój jak również ujawniają się w ich wyglądzie.
DNA- jest łańcuchem spiralnie skęconym, na każdy skręt spirali przypada 10 par nukleotydów. Na zewnątrz łańcucha DNA wystepuje cukier i reszta fosforanowa a zasady są upakowane wewnątrz łańcucha. DNA przechowuje informacje o budowie białek i RNA.
Przebieg replikacji:
- rozplecenie podwójnego łańcucha na 2 nici( idełki replikacyjne)
- dobudowanie dla każdego z nukleotydów komplementarnego trifofonukleotydu, odłączenie się 2 grup fosforanowych dostarcza energii do utworzenia wiązań między nukleotydami
- 2 nowe łańcuchy DNA są identyczne z macierzystymi, proces replikacji DNA katalizuje wiele enzymów np. polimeraza DNA.
Komórki grzybów nie zawierają plastydów!
Rośliny nie wytwarzają przeciwciał!
Całe DNA to genom (30tys. Genów + obszary międzygenowe)
W genach są obszary kodujące (eksony) i nie kodujące (introny)
Aminokwasy w białkach połączone są wiązaniami peptydowymi
Pseudogeny- geny właściwe, które w procesie ewolucji uległy mutacji. Może to dotyczyć jednego lub kilku nukleotydów.
Budowa ściany komórkowej:
- wielocukry:
*aminowe (chityna, chitozan)
*nieaminowe (celuloza, glukan, mannan)
Metody oceny wyizolowanego DNA:
- elektroforetyczna (ilość i czystość)
- spektrofotometryczna (ilość i czystość)
- fluorymetryczna (ilość)
Bufor obciążający w elektroforezie składa się z:
- ksylenian
- błękit bromofenylowy
- glicerol
Łamliwość podstawy źdźbła powodują:
Tapesia acuformis (R typ)
Tapesia yallundae (W typ)
Septoriozę paskowaną liści powoduje:
Septaria tritici
SCAR - specyficzne. primery
RAPD - losowe primery (8-12 nukleotydowe)
Multiplex PCR - zastosowanie różnych primerów naraz
Markery - urządzenia za pomocą których wykrywamy jakąś cechę
r-DNA - gen kodujący rybosomalny RNA
Chemotyp- organizm wytwarzający określony typ toksyny
Toksyny:
* NIV- Nivelenol (Fusarium cerealia) - bardziej toksyczny
* DON- Deoksynivalenol (Fusarium culmorum, F. gramineareum)
PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy. Jest metodą syntezy in vitro specyficznych fragmentów DNA o określonej długości i sekwencji z małych ilości matrycowego DNA.
Zastosowanie PCR:
- badanie skuteczności fungicydów na poszczególne gatunki grzybów w warunkach polowych
- testowanie odporności nowych odmian roślin na choroby
- przewidywanie wystąpienia choroby
- badania epidemiologiczne
- badania struktury genetycznej populacji patogenów
Antygeny:
- białka, polisacharydy, kwasy nukleinowe
- obca cząsteczka w organizmie zdolna do wywołania syntezy przeciwciała
Limfocyty B - białe krwinki syntetyzujące przeciwciała.
Budowa przyrządu do pomiaru intensywności fotosyntezy:
- konsola (komputer, pompy, siłowniki, silniki, sensory)
* desykant - środek pochłaniające nadmiar wody)
* sodalain - pochlania nadmiar CO2
- inektor - system wtryskowy CO2,
- komora pomiarowa
Metody diagnostyki chorób roślin:
- tradycyjnie
- immunologiczne
- biologii molekularnej
Metoda tradycyjna- opiera się na objawach chorobowych (klasyczna) Polega na hodowli testowanego materiału w warunkach laboratoryjnych na odpowiedniej pożywce po czym robi się ocenę wizualną wyrosłych mikroorganizmów za pomocą mikroskopu.
Wady metody tradycyjjnej:
- zbyt późne podjęcie środków zaradczych
- częste pomyłki w rozpoznawaniu choroby w wyniku niespecyficznych objawów choroby
- identyfikacja grzybów jest możliwa gdy osiągnie ona w hodowli laboratoryjnej stadium zarodnikowe
Czynniki powodujące choroby:
- infekcyjne (abiotyczne)- temp., wilgotnośc, niedostatek lub nadmiar subst. Pokarmowych, światło
- nieinfekcyjne (biotyczne)- grzyby, bakt., wirusy, mikoplazmy, wiroidy
Dlaczego wyst. choroby bez specyficznych objawów?
- specyficzne działanie patogena
- mniejsza wrażliwośc roślin na tego patogena
- zakażenia roślin patogena o mniejszej wirulencji
- wpływ czynników zew. np. temp., wilg., światło.
Termocykler -- zbudowany jest z procesora komputerowego, ukł. Grzewczego i ukł. Chłodzącego. Jest to elektronicznie sterowany termostat, stosowany do przeprowadzenia reakcji PCR. Próbki Dna umieszcza się w bloku termocyklera.
Etapy testu Elisa:
1.Powlekanie płytki roztworem immoglobuliny (przeciwciała), inkubacja 2h temp.37 C, płukanie 3x buforem
2. Nanoszenie soku z testowanych prób (rozcieńczonych buforem) inkubacja do następnego dnia w 4 C, płukanie 3x buforem
3. Nanoszenie roztworu koniugatu; inkubacja 3h 37 C, płukanie 3x buforem
4. Nanoszenie roztworu substratu; inkubacja i 1h w temp. pokojowej
Ocena reakcji wizualna lub fotometryczna. Dla wyników pozytywnych reakcja o różnej intensywności.
Aby zaszła reakcja muszą być spełnione następujące warunki:
- przeciwciało IgG dla naszego białka - antygen
- antygen (sprawca choroby) - obcy
- koniugat - przeciwciało znakowane enzymem np. alkaliczna fosfataza
- substrat - P-nitrofenylofosfat - związek chemiczny o bezbarwnych cząsteczkach, a przy zetknięciu z fosfatazą powoduje reakcję barwną
- bufory:
*powlekający do rozcieńczenia
*do płukania
*do próbek i koniugatu
*substratowy