Chromatografia (gr. chromatos = barwa + grapho = pisze) to technika analityczna lub preparatywna służąca do rozdzielania lub badania składu mieszanin związków chemicznych.
W każdej technice chromatograficznej najpierw rozdziela się badaną mieszaninę a następnie przeprowadza się detekcję poszczególnych składników. Rozdział substancji następuje w wyniku przepuszczenia roztworu badanej mieszaniny przez specjalnie spreparowaną fazę rozdzielczą (złoże), zwaną też fazą stacjonarną. Fazą rozdzielczą są substancje wykazujące zdolności sorpcyjne lub zdolne do innych oddziaływań na substancje przepływające. Podczas przepływu eluenta (fazy ruchomej) (w chemicznej technice analitycznej zwanej chromatografią jest to płyn (gaz lub ciecz), który pełni funkcję czynnika przenoszącego analizowaną mieszaninę przez złoże, na którym następuje jej rozdział na poszczególne związki. Eluentami są zwykle związki chemiczne o niskiej maasie cząsteczkowej, które nie reagują ze złożem i przechodzą przez to złoże przy jak najmniejszych oporach przepływu. Na wynik analiz chromatograficznych bardzo duży wpływ ma czystość eluentów. Niektóre z technik chromatograficznych (elektroforeza, HPLC) wymagają też odgazowywania eluentów.
W chromatografii gazowej eluentem jest gaz techniczny o jak najmniejszej masie cząsteczkowej - zwykle wodór lub współcześniej częściej hel.
W chromatografii cieczowej eulentem jest jakiś rozpuszczalnik lub ich mieszanina. Do najczęściej stosowanych eluentów ciekłych zalicza się: woda, etanol, THF, chlorek metylenu, chloroform, aceton, toluen. W TLC i chromatografii bibułowej eluent określa się mianem układu rozwijającego) przez fazę rozdzielczą następuje proces wymywania zaadsorbowanych (lub związanych) substancji. Intensywność tego procesu jest różna dla poszczególnych składników mieszaniny. Jedne składniki są więc zatrzymywane w fazie dłużej, a inne krócej, dzięki czemu może następować ich separacja. Czas przebywania danego składnika w kolumnie określany jest mianem czasu retencji. W zależności od rodzaju eluenta czyli substancji w której rozpuszcza się badaną mieszaninę rozróżnia się następujące techniki chromatograficzne:
chromatografia cieczowa - w której eluentem jest jakiś ciekły rozpuszczalnik
chromatografia gazowa - w której eluentem jest gaz (zwykle wodór lub hel).
W zależności od rodzaju i sposobu przygotowania fazy rozdzielczej:
TLC - thin layer chromatography, chromatografia cienkowarstwowa - w której fazę rozdzielczą stanowi cienka warstwa żelu naniesiona na sztywną płytkę. Na tak spreparowaną płytkę nanosi się próbkę roztworu, po czym na skutek działania sił kapilarnych, grawitacji lub pola elektrycznego następuje przepływ i rozdział mieszaniny;
chromatografia bibułowa - w której fazę rozdzielczą stanowi pasek lub arkusz bibuły filtracyjnej lub specjalnego typu bibuły chromatograficznej;
chromatografia kolumnowa - w której faza rozdzielcza jest umieszczona w specjalnej kolumnie, przez którą przepuszcza się następnie roztwór badanej mieszaniny. Przepływ roztworu przez kolumnę można wymuszać grawitacyjnie lub stosując różnicę ciśnień na wlocie i wylocie kolumny;
chromatografia powinowactwa - w której odpowiednio spreparowana faza rozdzielcza jest zdolna do oddziaływań chemicznych o zmiennym powinowactwie wobec rozdzielanych substancji;
chromatografia jonowymienna - w której substancje oddziaływują ze złożem za pomocą oddziaływań jonowych.
W zależności od parametrów procesu:
HPLC - high performance/pressure liquid chromatography, wysokosprawna/ciśnieniowa chromatografia cieczowa - odmiana cieczowej chromatografii kolumnowej z użyciem eluenta pod wysokim ciśnieniem;
FPLC - fast protein/performance liquid chromatography - szybka, białkowa/szybkosprawna chromatografia cieczowa - odmiana HPLC działająca na niższych ciśnieniach, stosująca prócz złóż sorpcyjnych, także zwykłe złoża typu sit molekularnych, służąca głównie do rozdziału białek i polipeptydów. Opatentowana i wyłączna nazwa dla firmy Pharmacia.
TLC (ang. Thin Layer Chromatography - cienkowarstwowa chromatografia cieczowa) - to metoda głównie analityczna, lecz także preparatywna, służąca do oczyszczania i identyfikacji mieszanin substancji chemicznych.
Jest to rodzaj chromatografii cieczowej.
Faza rozdzielcza, złoże, czyli faza stacjonarna o właściwościach sorbcyjnych (krzemionka, tlenek glinu) jest umieszczona jako cienka (do 1-2mm) warstewka na płytce szklanej lub z tworzywa sztucznego.
Substancje rozdzielane nakrapia się punktowo przy dolnej krawędzi płytki, po czym płytkę umieszcza się w komorze chromatograficznej zanurzoną na kilka milimetrów w eluencie (zwanym często tu, i w chromatografii bibułowej, układem rozwijającym), tak by nakropione substancje nie zostały zanurzone. Eluent stopniowo 'wspina' się po płytce (przy udziale sił kapilarnych) powodując ruch substancji rozdzielanych w górę ("rozwijanie się" chromatogramu). Prędkość ruchu poszczególnych składników rozdzielanej mieszaniny jest uzależniona od oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami chemicznymi tworzącymi analizowaną próbkę, a fazą rozdzielczą i eluentem. Gdy czoło eluenta dotrze do górnej krawędzi płytki rozdział jest zakończony.
Zależnie od swojej natury fizykochemicznej - składniki rozdzielanej mieszaniny dotarły na różną wysokość płytki (współczynnik Rf). W przypadku, gdy nie są naturalnie barwne, ich obecność można wizualizować używając zależnie od ich właściwości światła UV, roztworów wywołujących (w których płytka jest zanurzana lub nimi spryskiwana - reagują one specyficznie i barwnie z rozdzielanymi substancjami) lub innych metod (np. wywoływanie w parach jodu).
W preparatywnej TLC substancje po rozdziale można wydrapać z płytki razem ze złożem, po czym je odzyskać przez wymywanie z niego.
Chromatografia jonowymienna to rodzaj chromatografii kolumnowej, w której faza stacjonarna jest obdarzona ładunkiem. Tego rodzaju chromatografii używa się do oddzielania takich związków jak aminokwasy, peptydy i białka. Fazę stacjonarną stanowi zazwyczaj żywica jonowymienna, zawierająca obdarzone ładunkiem grupy funkcyjne, oddziałujące z przeciwnie naładowanymi grupami związków, które mają zostać zatrzymane przez nośnik:
pozytywnie naładowany jonowymieniacz (anionit) wiąże aniony
negatywie naładowany jonowymieniacz (kationit) wiąże kationy.
Adsorbent - to ciało o bardzo rozwiniętej powierzchni, na której zachodzi proces polegający na powierzchniowym wiązaniu cząsteczek płynu (cieczy lub gazu) przez cząsteczki ciała stałego, zwany adsorbcją. Powoduje to zatężanie substancji rozcieńczonej (adsorbatu). Adsorbenty możemy podzielić według różnych cech:
dyspersji:
o dużej dyspersji wewnętrznej, tj. porowate (węgiel aktywny, silikażel, sita molekularne, zeolity) powierzchnia rzędu 10 - 1000 m2/g i więcej)
rodzaju adsorbcji:
adsorpcja fizyczna - cząstki adsorbantu nie zmieniają swoich własności
adsorpcja chemiczna (chemisorpcja) - tworzenie powierzchniowych związków chemicznych z adsorbentem
rozmiaru porów:
adsorbenty mikroporowate (<2 nm)
adsorbenty mezoporowate (2-50 nm)
adsorbenty makroporowate (>50 nm)
Prawo podziału Nernsta albo krótko prawo podziału określa sposób, w jaki dowolna substancja chemiczna ulega podziałowi pomiędzy dwie oddzielone od siebie, ale pozostające w kontakcie fazy objętościowe (ośrodki). Układy, w których może zaistnieć równowaga podziałowa (rodzaj równowagi dynamicznej), to np. gazy lub pary rozdzielone membraną półprzepuszczalną, gaz i ciecz oraz dwie ciecze niemieszające się lub oddzielone membraną.
Prawo podziału Nernsta wyraża się wzorem:
gdzie: KX(12) - stała podziału substancji X pomiędzy fazy "1" i "2" (zwana też współczynnikiem podziału), [X]i - stężenie substancji X w fazie "i"
Należy podkreślić, że równanie określa równowagowe stężenia w obu fazach, natomiast ilości substancji w obu fazach zależą od objętości (stosunku objętości) obu faz.
W powyższym wzorze stężenie [X] (do wyrażenia stężenia często używa się symbolu c) można składnika obecnego w fazie gazowej zastąpić ciśnieniem p wg wzoru wynikającego z równania Clapeyrona (równania stanu gazu idealnego):
oraz
W praktycznych zastosowaniach przyjęło się, że dla podziału substancji w układzie gaz/ciecz oraz ciecz/ciecz w liczniku równania umieszcza się stężenie (lub ciśnienie) składnika w górnej fazie (gaz lub ciecz o niższej gęstości). Jeżeli układ składa się z cieczy organicznej i wody, wówczas najczęściej faza organiczna ("o") jest fazą górną, a faza wodna ("w") jest fazą dolną i prawo podziału możemy zapisać jako:
- w układzie ciecz organiczna/woda:
Wyszukiwarka