Analiza jakościowa - polega na identyfikacji związków lub zawartych w substancji pierwiastków. Można ją wykonać w dwojaki sposób. Pierwszy to zastosowanie wiadomych wzorców. Parametry retencji takie jak: czas retencji, temp. wrzenia, liczba at. „C” w stałych warunkach są stałe dla danych substancji. Inaczej mówiąc ta sama substancja w tych samych warunkach będzie miała te same parametry retencji. Porównując te parametry z parametrami wzorców pozwala nam zidentyfikować substancji. W przypadku gdy nie posiadamy odpowiedniego wzorca przydaje się drugi sposób. Wykorzystuje on istniejące zależności parametrów retencji z niektórymi własnościami fizykochemicznymi związków lub grup związków. Przykładem takiego zestawienia może być na przykład zestawienie logtr z tempw [Tw]. Związków danej grupy daje na wykresie linie prosta. Tak samo jest w przypadku zestawienia logtr z liczba at. „C” Tworzą one zależności liniowe, dzięki którym jesteśmy w stanie przewidzieć z jakim związkiem mamy do czynienia lub chociaż dzięki wskazaniu np. liczby at. „C” pozwoli nam zacieśnić grupę przeszukiwanych związków.
Wyznaczanie ilości półek teoretycznych - jest kluczowym elementem potrzebnym do określenia sprawności kolumny. Sprawność kolumny jest to jej zdolność do rozdziału substancji. Półka teoretyczna jest to najmniejsza cześć kolumny, w której osiągnięty jest stan równowagi stężenia substancji badanej w fazie ruchomej i stacjonarnej.
Wysokość półek teoretycznych obliczamy ze wzoru:
H = L/N
Gdzie: L - długość kolumny
N - liczba półek teoretycznych
Istnieje kilka metod analizy ilościowej:
metoda kalibracji
metoda normalizacji wewnętrznej
metoda wzorca wewnętrznego
Półka teoretyczna - najmniejsza część objętości kolumny, w której zostaje osiągnięty stan równowagi pomiędzy stężeniem substancji chromatografowanej w fazie ruchomej i w fazie stacjonarnej
W tym ćwiczeniu skupimy się na drugiej metodzie czyli „normalizacji wewnętrznej”. Jest ona najprostszą metoda. Polega na wyznaczeniu powierzchni piku każdego składnika. Sumując te powierzchnie i przyjęciu, że wartość sumy odpowiada całej próbce można tę sumę rozdzielić kolejno na powierzchnie poszczególnych składników próbki i mnoży przez 100. „ Procent powierzchniowy” i - tego składnika
Wynik tak obliczonych procentów jest zawsze równy 100%. Daje nam to już ogólny obraz wyglądu składu naszej próbki. Jednak metoda ta nie jest metodą pozbawioną błędów. Poprawność wyników wymaga stosowania współczynników korekcyjnych. Powierzchnia pików nie jest bowiem miarą ilości związku wprowadzonego na kolumnę, gdyż wskazania detektora zależą nie tylko od ilości składnika, ale także od jego przewodnictwa cieplnego (dla katarometru) czy tez budowy chemicznej (dla FID-u), lub innych czynników. Zastosowanie współczynnika korelacyjnego polega na traktowaniu jednego ze składników mieszaniny jako substancję wzorcową i przyjmuje się umownie, że jej współczynnik korekcyjny jest równy jedności. Oblicza się dla każdego składnika znanej mieszaniny, zbliżonej składem do badanej, współczynniki f (wagowy i objętościowy) w stosunku do wspomnianego wzorca.
Indeksy retencji - to parametry charakterystyczne dla danego związku w danej temperaturze i w obecności określonej fazy stacjonarnej w odróżnieniu od innych parametrów retencji.
Indeksy retencji w niewielkim stopniu zależą od temperatury kolumny.
Indeksy retencji substancji niepolarnych nie zmieniają się podczas zmiany niepolarnej fazy stacjonarnej na polarna,natomiast zmiana taka występuje w przypadku związków polarnych
Indeks retencji - substancji jest równy 100x liczbie atomów węgla hipotetycznego n-alkanu mającego taki sam zredukowany czas retencji jak badana substancja. Zgodnie z konwekcją alkany mają w każdej temperaturze i dla każdej fazy ciekłej indeks równy liczbie atomów węgla x100, np. n-pentan 500, n-oktan 800.
W szeregach homologicznych obserwuje się zależność pomiędzy parametrami retencji i wielkościami takimi jak liczba atomów węgla, liczba grup CH2 i temperatura wrzenia. Mogą one być uzyskane do identyfikacji nieznanych zwiazków.
Jeżeli wykreślić tR w funkcji liczby atomów węgla, to otrzymane proste są charakterystyczne dla każdego szeregu homologicznego w danej temperaturze. W ten sposób udaje się na tej drodze przyporządkowanie nieznanego związku do szeregu homologicznego i tym samym także jego identyfiakcję.
Analiza jakościowa metodą analizy wzorca wewnętrznego(metoda kalibracji bezwzględnej).
Stosuje się w każdych przypadkach chromatografii. Dwu, trzy krotnie nastrzykuje się próbkę badaną, przy czym piki muszą być podobne(muszą się pokrywać wysokości i szerokości pików). Natomiast, gdy się nie pokrywają trzeba powtórzyć nastrzyki aż powtórzą się piki. Następnie należy zrobić kalibrację dla danej substancji. W tym celu nastrzykuje się różne objętości pojedynczej substancji wzorcowej lub mieszaniny wzorcowej. W tym przypadku mieszanina musi odpowiadać substancji, którą chcemy oznaczać. Drugi wariant to te same objętości wzorca, ale o różnych stężeniach. Na podstawie otrzymanych analiz oblicza się średnią wielkość wysokości, powierzchni piku i wykreśla się wykres zależności wysokości(powierzchni) piku od ilości(stężenia) substancji wzorcowej. Na wykresie zależność powierzchni piku od stężenia substancji przedstawiona jest w postaci krzywej wzorcowej. Z wykresu można odczytać stężenie oznaczanej substancji znając powierzchnię piku tej substancji, po przez poprowadzenie linii poziomej przy określonej wartości powierzchni piku substancji oznaczanej do krzywej wzorcowej i rzutowanie pionowo na oś x, z której będziemy mogli odczytać stężenie oznaczanej substancji. Metoda ta wymaga wzorców o dużej czystości i jest czasochłonna oraz jest czuła na błędy w dozowaniu. Zmiany warunków analizy w istotnym stopniu wpływają na wyniki, dlatego analizy przeprowadzane powinny być w jednakowych warunkach chromatografowania.
Analizy jakościowej w chromatografii dokonuje się na podstawie pomiarów całkowitych czasów retencji poszczególnych substancji. Najpierw dokonuje się pomiarów całkowitych czasów retencji dla substancji wzorcowych a następnie dla próbki badanej. W celu zidentyfikowania składu próbki badanej porównuje się otrzymane całkowite czasy retencji dla substancji wzorcowych z próbka badaną. Jeśli kilka substancji ma bardzo zbliżone czasy retencji do siebie, dokonuje się analizy na dwóch różnych kolumnach ( o różnych wypełnieniach).
Całkowity czas retencji ( tr) - czas od momentu wprowadzenia próbki do maksimum piku danej substancji na wyjściu z kolumny. Maksimum piku odpowiada maksymalnemu stężeniu substancji w detektorze.
Wykresy logarytmiczne.
Wykres zależności logarytmu czasu retencji od liczby atomów węgla ma postać linii prostej. Wykonując wykresy dla kilku szeregów homologicznych otrzymuje się linie proste w przybliżeniu równoległe.
Wykres zależności logarytmu czasu retencji od temperatury wrzenia ma również postać linii prostych ( w niektórych przypadkach łamanych) przechodzących przez środek wykresu przedstawiającego współzależność czasów retencji dwóch kolumn.
Wykresy dla szeregów homologicznych nie przechodzą przez początek układu współrzędnych.
Współczynniki korekcyjne - współczynniki uwzględniające różne reakcje detektora na poszczególne składniki.
Analiza jakościowa metodą analizy wzorca wewnętrznego(metoda kalibracji bezwzględnej).
Stosuje się w każdych przypadkach chromatografii. Dwu, trzy krotnie nastrzykuje się próbkę badaną, przy czym piki muszą być podobne(muszą się pokrywać wysokości i szerokości pików). Natomiast, gdy się nie pokrywają trzeba powtórzyć nastrzyki aż powtórzą się piki. Następnie należy zrobić kalibrację dla danej substancji. W tym celu nastrzykuje się różne objętości pojedynczej substancji wzorcowej lub mieszaniny wzorcowej. W tym przypadku mieszanina musi odpowiadać substancji, którą chcemy oznaczać. Drugi wariant to te same objętości wzorca, ale o różnych stężeniach. Na podstawie otrzymanych analiz oblicza się średnią wielkość wysokości, powierzchni piku i wykreśla się wykres zależności wysokości(powierzchni) piku od ilości(stężenia) substancji wzorcowej. Na wykresie zależność powierzchni piku od stężenia substancji przedstawiona jest w postaci krzywej wzorcowej. Z wykresu można odczytać stężenie oznaczanej substancji znając powierzchnię piku tej substancji, po przez poprowadzenie linii poziomej przy określonej wartości powierzchni piku substancji oznaczanej do krzywej wzorcowej i rzutowanie pionowo na oś x, z której będziemy mogli odczytać stężenie oznaczanej substancji. Metoda ta wymaga wzorców o dużej czystości i jest czasochłonna oraz jest czuła na błędy w dozowaniu. Zmiany warunków analizy w istotnym stopniu wpływają na wyniki, dlatego analizy przeprowadzane powinny być w jednakowych warunkach chromatografowania.