Objętość DCMU [μl] |
Absorpcja początkowa A0 |
Absorpcja końcowa AK |
Czas reakcji [s] |
Aktywność chlorofilu |
Średnia aktywność i odchylenie standardowe |
% średniej aktywności i % odchyl. standard. |
0 |
0,1305 |
0,0522 |
19,4 |
30082 |
27883 |
100 |
|
0,1713 |
0,1057 |
17,2 |
28426 |
S=2382 |
S=9 |
|
0,1857 |
0,1249 |
18,5 |
24495 |
|
|
|
0,3028 |
0,2339 |
18 |
28530 |
|
|
1 |
0,1500 |
0,1375 |
19 |
4903 |
6899 |
25 |
|
0,2099 |
0,1881 |
18,2 |
8927 |
S=2692 |
S=10 |
|
0,2202 |
0,1974 |
17,9 |
9493 |
|
|
|
0,2647 |
0,2549 |
17,1 |
4271 |
|
|
2 |
0,1185 |
0,1115 |
17,1 |
3051 |
4223 |
15 |
|
0,1119 |
0,1023 |
17 |
4208 |
S=2488 |
S=9 |
|
0,2681 |
0,2517 |
15,9 |
7687 |
|
|
|
0,2545 |
0,2587 |
16,1 |
1944 |
|
|
4 |
0,272 |
0,2799 |
17,3 |
3403 |
4278 |
15 |
|
0,2437 |
0,2464 |
18,2 |
1105 |
S=2519 |
S=9 |
|
0,1391 |
0,1534 |
17,1 |
6232 |
|
|
|
0,2538 |
0,2703 |
19,3 |
6372 |
|
|
5 |
0,2776 |
0,2933 |
17,1 |
6843 |
6858 |
25 |
|
0,0411 |
0,0603 |
18 |
7950 |
S=933 |
S=3 |
|
0,3301 |
0,3438 |
18 |
5672 |
|
|
|
0,2664 |
0,2822 |
16,9 |
6968 |
|
|
8 |
0,1493 |
0,1420 |
18,8 |
2894 |
2900 |
10 |
|
0,3505 |
0,3392 |
17,9 |
4705 |
S=1594 |
S=6 |
|
0,2277 |
0,2349 |
16,9 |
3175 |
|
|
|
0,3518 |
0,3498 |
18 |
828 |
|
|
12 |
0,2598 |
0,2653 |
18 |
2277 |
5370 |
19 |
|
0,3312 |
0,3327 |
17,8 |
628 |
S=6836 |
S=25 |
|
0,3404 |
0,3101 |
17,1 |
13206 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
15 |
0,4079 |
0,4156 |
17,4 |
3298 |
4016 |
14 |
|
0,3046 |
0,3119 |
17,2 |
3163 |
S=1289 |
S=5 |
|
0,2833 |
0,2921 |
17,8 |
3684 |
|
|
|
0,3683 |
0,3826 |
18 |
5921 |
|
|
20 |
0,288 |
0,2909 |
19,2 |
1125 |
3367 |
12 |
|
0,3101 |
0,3194 |
17 |
4077 |
S=1921 |
S=9 |
|
0,3022 |
0,3084 |
17,4 |
2655 |
|
|
|
0,3641 |
0,3775 |
17,8 |
5610 |
|
|
25 |
0,3113 |
0,3372 |
17 |
11355 |
5970 |
21 |
|
0,1555 |
0,1607 |
19 |
2039 |
S=4825 |
S=17 |
|
0,3559 |
0,3662 |
17 |
4515 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
50 |
0,2162 |
0,2074 |
18,6 |
3526 |
5260 |
18 |
|
0,1313 |
0,1354 |
18,4 |
1660 |
S=7087 |
S=25 |
|
0,0624 |
0,0283 |
16,2 |
15688 |
|
|
|
0,1441 |
0,1445 |
17,8 |
167 |
|
|
Sprawozdanie z ćwiczeń
preparacja tylakoidów i spektrofotometryczny pomiar aktywności PSII
Barbara Jeżowska
Marta Hojka
Marta Samol
Maciej Kaczurba
Jakub Kubiak
Ćwiczenie nr1. Preparacja tylakoidów z liśći groszku.
Do preparacji użyto 30g liści. Homogenizowano je przez 60 s w 150 ml izoosmotycznego buforu, w celu uwolnienia zawartości komórek bez doprowadzania do lizy chloroplastów. Homogenizat przesączono przez 4 warstwy tetry w celu oddzielenia niezhomogenizowanego materiału roślinnego ( od tej pory wszystkie czynności odbywały się na łaźni lodowej w celu zabezpieczenia materiału przed proteolizą ).
Przesącz rozdzielono do 2 probówek i wirowano w 1000g, przez 3 min. (t = 4°C), supernatant odrzucono a osad zawieszono w buforze do przemywania ( hiperosmotyczny - doprowadził do lizy osmotycznej chloroplastów i uwolnienia tylakoidów ). Ponownie wirowano w 1000g przez 30 s (t = 4°C) w celu usunięcia całych chloroplastów i innych ciężkich składników komórek. Osad odrzucono, a supernatant wirowano w 3000g przez 5 min (t = 4°C), supernatant odrzucono a osad tylakoidów zachowano do doświadczeń (w ćwiczeniu2 ).
W celu oceny ilości chlorofilu w preparatach przeprowadzono pomiar spektofotometryczny przy λ = 652 nm, w 80% roztworze acetonu.
Do wyliczeń użyto wzoru: 5.8 ∗ A652 = stężenie chlorofilu [mg/ml].
A1= 0.437 → c1 = 2.54 mg/ml
A2= 0.531 → c2 = 3.08 mg/ml
Ćwiczenie nr2. Spektrofotometryczny pomiar aktywności PSII.
Pomiar aktywności prowadzono w układzie H2O→PSII→DCPIP. Do kolejnych prób dodawano wzrastającą ilość inhibitora PSII - DCMU, mierzono jego wpływ na aktywność PSII. W 2 ostatnich próbach zbadano wpływ szoku cieplnego na aktywność PSII (5 min. w temp 50°C ), w ostatniej próbie dodano dodatkowo sztuczny donor elektronów DPC.
Pomiar przeprowadzano dodając do 2 ml układu pomiarowego roztwór tylakoidów zawierających 30 μg chlorofilu i naświetlając próbę światłem Vis. Mierzono zmianę absorpcji próby pochodzącą od zmian ilości zredukowanego DCPIP ( ε = 16100 mol-1 , M = 268 g/mol ) i mierzono czas reakcji.
Aktywność PSII obliczano ze wzoru:
a = ( μmol zred. DCPIP ) ∗ ( mg chlorofilu )-1 ∗ ( 1 godz.)-1
Dla każdego układu wykonano po 4 pomiary.
Wyniki zebrano w tabeli i na wykresie.
Obserwowano wyraźne zmniejszenie aktywności chlorofilu w miarę dodawania DCMU.
DCMU ( 3-(3,4-dichlorofenylo)-1,1-dimetylomocznik ) jest inhibitorem PSII, blokuje transport elektronów po stronie redukcyjnej. Spadek aktywności jest tak szybki, że nie można było zmierzyć połówkowego spadku aktywności. Po dodaniu pierwszej porcji DCMU aktywność spadła o 75%, następne porcje nie wnosiły dużych zmian, fluktuacje aktywności mieszczą się w przedziale błędu ( aby unaocznić ten fakt, na wykresie nanieśliśmy oprócz średnich aktywności, również odchylenia standardowe ). Stwierdzono, że połówkowy spadek aktywności następuje przy dodaniu mniejszej ilości DCMU niż 1 μl.
W próbach szoku cieplnego widać znaczny spadek aktywności PSII:
Pomiar |
Absorpcja początkowa |
Absorpcja końcowa |
Czas reakcji [s] |
Aktywność chlorofilu |
Średnia aktywność i odchylenie standardowe |
% średniej aktywności i % odchyl. standard |
Pomiar kontrolny |
0,4967 |
0,3675 |
21 |
45856 |
35021 |
100 |
|
0,5298 |
0,4301 |
17 |
43712 |
S=11401 |
S=33 |
|
0,5016 |
0,4218 |
22 |
27035 |
|
|
|
0,4918 |
0,4225 |
22 |
23478 |
|
|
Szok cieplny |
-0,0160 |
-0,0114 |
45 |
745 |
840 |
2,4 |
|
-0,0710 |
-0,0612 |
50 |
1490 |
S=609 |
S=1,7 |
|
-0,0760 |
-0,0764 |
21 |
283 |
|
|
Szok cieplny + DPC |
-0,1050 |
-0,1100 |
90 |
447 |
869 |
2,5 |
|
-0,1200 |
-0,1318 |
83 |
1032 |
S=374 |
S=1,1 |
|
-0,1230 |
-0,1356 |
70 |
1299 |
|
|
|
-0,1290 |
-0,1342 |
60 |
695 |
|
|
Szok cieplny prowadzi właściwie do wyłączenia PSII, nie wykazuje on znaczącej aktywności ( poziom 2,5% ). Wyłączenie kompleksu można by było tłumaczyć denaturacją kompleksu rozkładającego H2O, ale wtedy kompleks powinien reagować na DPC, który jest sztucznym donorem elektronów, wtedy reakcja mogła by przebiegać w układzie: DPC→PSII→DCPIP. Jednak PSII nie reaguje zwiększeniem aktywności w tym przypadku. Kompleks jest dalej wyłączony, co może wiązać się z poważnymi zmianami w części transmembranowej kompleksu.
Przykłady obliczeń jakich dokonano i wpisano w tabelę ( tu dla serii 1 ):
Obliczenia wykonywano w arkuszu kalkulacyjnym MS Excel.
Do dyspozycji mieliśmy dane z pomiaru:
Absorpcja początkowa A0
Absorpcja końcowa AK
Czas pomiaru t
Obliczono zmianę absorpcji ΔAN = A0 - AK
ΔA1= 0,1305-0,0522 = 0,0783
ΔA2= 0,1712-0,1057 = 0,0656
ΔA3= 0,1257-0,1249 = 0,0608
ΔA4= 0,3028-0,2339 = 0,0689
Przeliczono zmiany absorpcji na zmianę ilości zredukowanego DCPIP (ε = 16100 mol-1) a = ΔA/0,016100 ( w ten sposób otrzyma się wynik w μmol)
a1= 0,1292/0,016100 = 4,86
a2= 0,0997/0,016100 = 4,07
a3= 0,0798/0,016100 = 3,78
a4= 0,0693/0,016100 = 4,28
Przeliczono zmianę ilości zred. DCPIP na 1 mg chlorofilu ( z 0,03 mg)
a/0,03
a1= 4,86/0,03 = 162
a2= 4,07/0,03 = 136
a3= 3,78/0,03 = 126
a4= 4,28/0,03 = 143
Przeliczono zmianę ilości zred. DCPIP na 1 godzinę
( a / t [s] ) * 3600
a1= 30082
a2= 28426
a3= 24495
a4= 28530
Obliczono średnią aktywność ze wzoru:
a= [ Σ (ΔaN) ] / n , gdzie n - liczba składników sumy
a = 27883
oraz odchylenie standardowe od średniej (nie jest nam znany dokładny algorytm zastosowany w programie MS Excel ) w przybliżeniu może to być:
S= [ Σ (a- ΔaN) ] / n
S= 2382