Techniki Fluorescencji w Analizie instrumentalnej
∙Większa selektywność i specyficzność analiz
∙ bardzo niska granica oznaczalności ( ilość związku)
∙ bardzo niska granica wykrywalności ppb ppt 10 -12 g (pg)
∙ czułość - reakcja danej metody na zmianę ilości związku (substancji) - generuje się duża zmiana w emisji
3-6 razy większa niż w absorpcjometrii
Fluorofor jest częścią cząsteczki, odpowiada za jej fluorescencję, Najczęściej jest to grupa funkcyjna, zdolna do absorpcji energii o określonej długości fali, a później do wyeliminowania różnej długości fali ( ściśle określonej).
Ilość energii oraz długość fali emitowanej zależy od właściwości fluoroforu, ale również od środowiska chemicznego w jakim on działa (np. pH, czy siła jonowa).
Stosuje się zestawy fluoroforów.
Fluorofory jako znaczniki |
Ex |
Em |
Hydroksykumaryna Izotiocyjanian fluoresceiny(FITC) Tetrametylorodamina (TRITC) Indokarbocyjanina (Cys) |
325 495 547 625-650 |
386 519 572 670 |
Fluorofory wiążące się z kwasami nukleinowymi |
|
|
Hoechst 33342 SYTOX Green Chromomycin A3 Arcidine Orange |
343-483 504-523 445-573 503-430-640 |
AT-selektywny DNA CG-selektywny DNA i RNA |
Znaczniki fluorescencyjne:
∙ Systematyczne barwniki fluorescencyjne, charakteryzujące się dużą wydajnością kwantową
Fluorescencji, które wykazują nieaktywność względem określonych grup (aminowej tiulowej).Daje to możliwość znakowania niefluoryzujących związków (leków, białek, DNA) w celu ich detekcji i oznaczenia technikami fluorescencyjnymi.
Sondy fluorescencyjne:
∙ Jest fluoroformem, który lokalizuje się w specyficznym rejonie biologicznego obiektu lub opowiada na specyficzny czynnik stymulujący
∙ Sondy mogą lokalizować się w określonym regionie komórki lub wiązać się do określonych sekwencji wyizolowanego DNA.
∙ Mogą odpowiadać za działanie specyficznych enzymów
Rolę sony mogą pełnić:
∙ znaczniki fluorescencyjne
∙ fluoryzujące barwniki związane z oligonukleotydem np. sondy hybrydyzacyjne do ilościowego PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym)
∙ fluoryzujące barwniki związane z przeciwciałami np. sondy immunodluoresc., pozwalające wykrywać odpowiednie antygeny (np. na pow. Nowotworów)
∙ słabo fluoryzujące barwniki, które stają się fluoroforamii (FRET technika) o wysokiej wydajności kwantowej ф, dopiero wtedy gdy zwiąże się z określoną docelową molekułą.
∙ niefluoryzujące barwniki przekształcone w fluoryzujący produkt na drodze enzymatycznej (bardzo czuła metoda oznacznia aktywności enzymatycznej)
∙ związki wchodzące w skład żywych organizmów ; tryptofan , tyrozyna, fenyloalanina, porfiny, FAD, NAD
Szczególny rodzaj sond luminescencyjnych - fluorescencyjne sondy molekularne.
Stanowią one fragment genomowego DNA rozpoznający sekwencje różniące się zaledwie kilkoma nukleotydami i tworzą trwałe wiązania i komplementarnymi fragmentami kwasów nukleinowych, zwierają dołączone fluorofory.
Pozwalają na wykrywanie mutacji genowych, polimorfizmów.
Sonda typu „molecular bacon” - latarnia, boja molekularna
Fluorescencja ma miejsce dopiero wtedy, gdy sonda przyłączy się do kwasu nukleinowego będącego jej celem. Ukształtowana w postać szypułki do włosów(oligonukleotyd zawiera gr fluoroforu i gr. wygaszacza) z jednoniciowego DNA.
Fluorescencyjny rezonansowy transfer FRET
Proces w którym jedna cząsteczka (donor energii - D) przkazyje energię wzbudzenia innej cząsteczce ( aktywator - A)
D* + A D + A*
A* A + hυ
Przyrządy stosowane w technikach fluorescencyjnych
∙Spektrofluorymetry
- czytniki mikropłytek
- cytometry przepływowe - do żywych komórek (rozdział komórek ) lub makrocząsteczek (limfocyty, neutrofile, monocyty)
-mikroskpy fluorescencyjne - do obserwacji w skali mikro, identyfikacja fluoroforów obecnych na powierzchni lub wnętrzu żywych komórek.
- aparaty do elektroforezy kapilarnej (białka, DNA - do ich rozdziału)
- sekwenatory DNA
- skanery fluorescencyjne - dla obiektów makroskopowych w płytkach DNA/proteina (tzw. Dzip/olip(?)), żelach do elektroforezy, chromatografach w chromatografii cienkowarstwowej. Stosowany w oznaczeniach ilościowych protein i kwasów nukleinowych (porównanie z paskami o znanym stężeniu)
Zastosowanie sond fluorescencyjnych
∙ analiza ekspansji genów mRNA (mikromacierz)
∙ detekcja i oznaczanie białek , DNA, RNA
∙ analiza przeżywalności komórek
∙ badanie proliferacji
∙ detekcja stresu oksydacyjnego (zaburzenia cyklu tlenu - tlenek azoru)
∙ analiza aktywności enzymów
∙ analiza struktury błon komórkowych (ich integralność)
∙ jako indukatory pH (np. w komparmentach komórkowych)
Subkomórkowa struktura komórek
Fluorescencja niebieska jądrowa
Fluorescencja czerwona mitochondrium
Fluoresceina zielona aktyna mikrofilamentów
Nieuszkodzone żywe komórki - zielona
Uszkodzone żywe komórki - czerwona
Detekcja stresu oksydacyjnego
Pochodna fluoresceiny fluoryzuje na zielono utlenieniu przez ROS (rodniki).
Komórki nie poddane strsowi - brak fluorescencji.
Detekcja anionu ponadtlenowego w mitochondriach
Immunocytochemia - wykorzystująca reakcje antygenu- przeciwciała, umożliwia identyfikacje całej gamy patologicznych mikroorganizmów.
Komórki nowotworowe posteosarcoma
A - linia komórkowa prawidłowa ( szereg „dziki”)
B- linia komórkowa 60 (pozbawiona mitochondriom DNA)
Widoczne różnice w strukturze sieci mitochondrialnej.
Fluoryzacja hybrydyzacyjna in situ FISH
Wykrywanie specyficznych sekwencji DNA i RNA w chromosomach i na identyfikację aberracji chromosomowych. Fluorofor wbudowuje się w nić DNA i uwidacznia w określonym miejscu chromomu.
Badanie ekspansji genów na poziomie fragmentacji (mRNA) umożliwia ocenę ekspresji i setek genów (nawet tysięcy). Pozwala na porównanie ekspresji w stanach fizjologicznych i patologicznych (mikromacierz cDNA)
Zielone białko fluoryzujące
∙ białko wykazuje naturalną fluorescencję w obszarze widzialnym pochodzące z meduzy Aequorea Victoria
∙ gen GFP ulega ekspresji w komórkach bakterii, drożdży, roślin i ssaków co powoduje, że jest wstecznym narzędziem biologii molekularne (seryna, tyrozyna, glicyna) muszą ulec cyklicznej i dehydratacji, co prowadzi aż do powstania fluoryzującego układu sprzężonych wiązań podwójnych
Zastosowanie GFP
∙do oceny skuteczności …..
∙ jako gen reproterowy w badaniach aktywności promotorów i poziomu ekspresji genów znajdujących się pod ich kontrolą.
∙ do śledzenia interakcji pomiędzy białkami praz lokalizacji badanego białka w komórce (białka fuzyjne ułożone w GFP)
Mutanty GFP
∙powoliło otrzymać białka, które wykazują zwiększoną fluorescencję, zmianę długości emitowanego światła.
Niebiesko, czerwono, żółto
BFP RFP YFP
Przykłady oznaczeń:
-hormony (adrenalina, noradrenalina)
-wit (tiamina, ryboflawina)
-aminokwasy
-kwas foliowy
-cholesterol
- histamina
-fenyloamina
-środki farmaceutyczne ( antybiotyki, witaminy syntetyczne- barbihirany, aflatoksyny-, teksty wrażliwości na antybiotyki -aspiryna chloropromucyna, morfina-, toksykologia.)
- środki żywnościowe ( tłuszcze, węglowodany, cukry prote, zafałszowania win - sacharyna)
- związki nieorganiczne ( kation Al., Be, Ca, Ga, pierwiastki ziem rzadkich)
- środowiskowe ( stopień czystości wody - olej, zanieczyszczenia gleby, algi, bakteriologiczne E. Coli)