Dzięki hodowli można w warunkach laboratoryjnych (in vitro) namnażać drobnoustroje żyjące w środowisku naturalnym. Aby założyć hodowlę drobnoustrojów należy wprowadzić je do sterylnej pożywki, czyli posiać. Posiewane mikroorganizmy określa się mianem inokulum lub zaszczepu. Nie zawsze znamy skład drobnoustrojów tworzących zaszczep, np. kiedy posiewamy próbę środowiskową, w której zwykle znajduje się wiele różnorodnych bakterii i grzybów (woda, ścieki, gleba itp.). Posiane drobnoustroje inkubuje się, czyli przetrzymuje w pożywce określony czas (czas inkubacji), w określonej temperaturze (temperatura inkubacji). Podczas inkubacji posiane komórki rosną i dzielą się. Trzeba jednak wspomnieć, że są drobnoustroje, które nie rosną na żadnych pożywkach i nie można ich hodować, np. krętek blady, wywołujący kiłę lub prątek trądu.
Różne mogą być cele posiewu, a więc i założonej hodowli:
wyizolowanie określonych drobnoustrojów z prób środowiskowych (wody, gleby), w tym uzyskanie czystych szczepów, czyli zbiorów komórek pochodzących z jednej komórki macierzystej, z zamiarem ich dalszych badań (m.in. identyfikacji),
namnożenie komórek już wyizolowanego i zidentyfikowanego szczepu, np. w celu pozyskania pewnych produktów jego metabolizmu, lub zbadania jego zdolności do rozkładu określonych zanieczyszczeń,
policzenie komórek wchodzących w skład posiewanej próby.
Pożywka, w której prowadzi się hodowlę określonych drobnoustrojów musi zaspokajać ich wymagania odżywcze. Poza tym hodowla powinna być prowadzona w optymalnych dla wzrostu warunkach środowiskowych, takich jak temperatura, odczyn, natlenienie, ciśnienie osmotyczne.
Wymagania pokarmowe.
Wszystkie bakterie i grzyby potrzebują do wzrostu i rozmnażania się źródła energii, węgla, azotu i wielu innych składników pokarmowych. Określa to łatwy do zapamiętania skrót CHOPKNS, będący szeregiem symboli chemicznych najważniejszych pierwiastków. Oprócz wymienionych składników, w każdej pożywce niezbędna jest również obecność żelaza, magnezu oraz tzw. pierwiastków śladowych, koniecznych w bardzo małych stężeniach (np. Co, Mn, Zn, Cu, Mo, Ca).
Na szczególną uwagę zasługuje zapotrzebowanie na źródło energii i węgla. W przypadku mikroorganizmów autotroficznych źródłem energii jest promieniowanie słoneczne (fotoautotrofy) lub energia utleniania zredukowanych związków nieorganicznych (chemoautotrofy), źródłem węgla natomiast obecny w atmosferze CO2. Dlatego pożywki do hodowli autotrofów nie muszą zawierać związków węgla.
Dla heterotrofów natomiast źródłem energii i węgla są związki organiczne. Pod względem zapotrzebowania na związki organiczne mikroorganizmy dzieli się na dwie grupy:
prototrofy, wymagające do wzrostu tylko jednego rodzaju związku węgla,
auksotrofy, wymagające przynajmniej dwóch rodzajów związków węgla.
Prototrofy są wyjątkowo uzdolnione metabolicznie, gdyż potrafią wszystkie potrzebne składniki komórkowe zsyntetyzować z często bardzo prostych, nawet jednowęglowych związków wyjściowych, np. metanu czy mrówczanu. Są to przede wszystkim drobnoustroje żyjące w środowisku ubogim w składniki pokarmowe (woda, gleba), ale są wśród nich również mieszkańcy środowisk bogatych w pokarm, np. występująca powszechnie w jelicie człowieka pałeczka okrężnicy (Escherichia coli).
Auksotrofami są często drobnoustroje żyjące w innych organizmach, np. liczne bakterie i grzyby chorobotwórcze. Występuje wśród nich duża rozpiętość wymagań pokarmowych, od jednego dodatkowego związku (np. pałeczka duru brzusznego Salmonella typhi wymaga aminokwasu tryptofanu) po liczne aminokwasy, zasady purynowe, pirymidynowe i witaminy potrzebne bakteriom fermentacji mlekowej.
W mikrobiologii stosuje się różne rodzaje pożywek, w zależności od celu badań. Ze względu na konsystencję można je podzielić na:
płynne,
stałe,
półpłynne.
Pożywki płynne stosowane są zwykle do namnażania w celu otrzymania dużej biomasy komórek i pozyskiwania produktów ich metabolizmu. Przykładem może być bulion odżywczy, jedna z najczęściej używanych pożywek. Bulion jest mieszaniną peptonu (produktu enzymatycznej hydrolizy białek), wyciągu mięsnego (ekstraktu zawierającego m.in. zasady organiczne i witaminy) i NaCl, dodawanego dla zapewnienia odpowiedniego ciśnienia osmotycznego. Na bulionie dobrze rosną mikroorganizmy o średnich wymaganiach pokarmowych, jednak dla wielu drobnoustrojów żyjących w środowiskach ubogich w pokarm (glebowych i wodnych), jest on zbyt bogatą pożywką, hamującą ich rozwój. Z kolei dla bardzo wymagających bakterii chorobotwórczych bulion jest zbyt ubogi i musi być wzbogacony, np. o krew lub wyciąg drożdżowy. Tego typu pożywki określa się mianem wzbogaconych (patrz niżej).
Pożywki stałe stosuje się głównie do izolacji czystych szczepów, przechowywania ich, do badań morfologii kolonii, oraz w badaniach ilościowych (określaniu liczby komórek w próbie). Do zestalania pożywek płynnych używa się głównie agar, a także żelatynę. W przypadku hodowli niektórych bakterii autotroficznych, wrażliwych na większe stężenia związków organicznych, stosuje się żel krzemionkowy, którym zestala się pożywkę mineralną.
Agar jest mieszaniną dwóch polisacharydów: agarozy i agaropektyny, które są polimerami galaktozy. Jest on wytwarzany przez pewne glony morskie z grupy krasnorostów, jako składnik ich ścian komórkowych. Produkuje się go w postaci proszku lub granulek. Po wymieszaniu z wodą i podgrzaniu do temp. 95-980C agar rozpuszcza się, a w trakcie schładzania zachowuje swoją płynną konsystencję do temperatury ok. 45-480C, kiedy krzepnie przechodząc w galaretowaty żel. Sam agar (tzw. agar-agar) nie jest pożywką dla większości bakterii, gdyż nie potrafią go rozkładać. Jest on używany wyłącznie do zestalania pożywek płynnych (w ilości 1,5-2 %). Dodany do bulionu odżywczego tworzy tzw. agar odżywczy, w skrócie MPA.
Żelatyna, czyli tzw. klej kostny, jest białkiem otrzymywanym w wyniku dłuższego gotowania odpadków zawierających kolagen (skóra, kości). Wadą żelatyny jako podłoża mikrobiologicznego jest to, że rozpuszcza się ona już w temp. ok. 30-350C, a więc poniżej temperatury inkubacji wielu drobnoustrojów. Niektóre bakterie i grzyby potrafią rozkładać żelatynę upłynniając ją, co jest wykorzystywane w badaniach diagnostycznych (identyfikacyjnych).
Pożywki półpłynne mają konsystencję pośrednią między pożywkami płynnymi a stałymi, i zawierają 0,15-0,2 % agaru. Służą one do badania zdolności ruchu u bakterii. Po zaszczepieniu słupka z agarem półpłynnym, bakterie zdolne do ruchu będą się przemieszczać i, dzięki małej gęstości agaru, zasiedlą całą objętość pożywki. W efekcie licznych podziałów, po okresie inkubacji powstanie zmętnienie w całej objętości słupka agarowego. W przypadku bakterii nie zdolnych do ruchu, ich podziały komórkowe spowodują jedynie wzrost wzdłuż linii wkłucia.
Inny podział pożywek uwzględnia wymagania odżywcze drobnoustrojów:
pożywki proste,
pożywki wzbogacone,
pożywki specjalne,
pożywki wybiórcze (selektywne),
pożywki wybiórczo-namnażające,
pożywki wybiórczo-różnicujące.
Pożywki proste zaspokajają niskie i średnie wymagania pokarmowe mikroorganizmów. Należą tu m.in. omówione wyżej bulion i agar odżywczy. Stanowią one podstawę dla innych, bardziej złożonych pożywek.
Pożywki wzbogacone stosuje się do hodowli bardziej wymagających drobnoustrojów chorobotwórczych (np. paciorkowców i gronkowców), przystosowanych do życia w bogatym w substancje odżywcze środowisku wnętrza organizmu żywiciela. Czynnikiem wzbogacającym może być odwłókniona krew (często barania), wyciągi z narządów zwierzęcych, np. wątroby, wyciąg z drożdży, hydrolizat kazeiny - głównego białka mleka i inne.
Pożywki specjalne służą do hodowli drobnoustrojów o szczególnych wymaganiach odżywczych, takich jak prątki gruźlicy, dwoinki rzeżączki czy maczugowce błonicy. Używa się w nich wysokowartościowych składników odżywczych (żółtka jaj kurzych, surowice, witaminy).
Pożywki wybiórcze umożliwiają wzrost określonym drobnoustrojom (które chcemy wyizolować z próby) dzięki stworzeniu im sprzyjających warunków wzrostu lub dodanie składnika hamującego wzrost niepożądanych mikroorganizmów. Przykładem może być pożywka umożliwiająca wyosobnienie z gleby bakterii Azotobacter, wiążącej azot atmosferyczny. W pożywce tej nie ma związku zawierającego azot, pierwiastek niezbędny do wzrostu wszystkim komórkom. Tylko drobnoustroje zdolne do asymilacji (przyswojenia) azotu cząsteczkowego (N2) z powietrza mogą na takiej pożywce rosnąć. Poza tym, zawiera ona mannitol, ulubione źródło węgla bakterii Azotobacter. Innym przykładem mogą być pożywki zakwaszone, które są wybiorcze dla grzybów. Obniżony odczyn hamuje wzrost większości bakterii, które zwykle preferują odczyn obojętny lub lekko zasadowy, natomiast grzyby jako mikroorganizmy kwasolubne dobrze rosną i dzielą się na takich podłożach.
Pożywki wybiórczo-namnażające są często pożywkami płynnymi i umożliwiają nie tylko wyosobnienie określonego drobnoustroju (który zwykle występuje w znikomej ilości), ale też namnożenie go do dużej biomasy umożliwiającej dalsze badania (np. identyfikacyjne). Przykładem może być podłoże z kwaśnym selenianem sodowym, stosowane do izolacji pałeczek Salmonella np. z produktów żywnościowych lub gleby (selenian jest tu czynnikiem hamującym wzrost drobnoustrojów gramdodatnich, a zwłaszcza ziarniaków).
Pożywki wybiórczo-różnicujące umożliwiają nie tylko wzrost wybranym drobnoustrojom, ale też pozwalają je zróżnicować. Przykładem może być pożywka Endo, często stosowana w sanitarnych badaniach środowiska. Pozwala ona rosnąć jedynie bakteriom gramujemnym, czyli jest dla nich wybiórcza (obecność w podłożu fuksyny hamuje rozwój bakterii gramdodatnich), ale też umożliwia zróżnicowanie wyrosłych bakterii na zdolne, i nie zdolne do fermentacji laktozy. Podczas fermentacji tego cukru powstaje bowiem aldehyd octowy, który daje czerwone zabarwienie po połączeniu się z fuksyną (dotąd bezbarwną, bo zredukowaną przez siarczyn sodu, również dodawany do pożywki). Dlatego bakterie fermentujące laktozę (jak pałeczka okrężnicy) tworzą kolonie koloru czerwonego z metalicznym (tzw. fuksynowym) połyskiem, a nie zdolne do fermentacji - koloru różowego lub bezbarwne.
Pożywki dzieli się też na:
syntetyczne (o ściśle zdefiniowanym składzie ilościowym i jakościowym),
naturalne (o nie znanym dokładnie składzie, na bazie składników pochodzenia naturalnego, np. wyciąg z tkanek roślinnych lub zwierzęcych, krew, mleko itp.),
półsyntetyczne (pożywka mineralna o znanym składzie, plus składniki pochodzenia naturalnego, o nie sprecyzowanym dokładnie składzie).
Temperatura
Drobnoustroje wykazują duże zróżnicowanie wymagań termicznych, które muszą być uwzględnione podczas hodowli. Dla każdego mikroorganizmu można określić trzy tzw. temperatury kardynalne:
minimalną, poniżej której wzrost komórek i podziały nie występują,
optymalną, w której komórki rosną i dzielą się najszybciej,
maksymalną, powyżej której wzrost i podziały nie zachodzą.
Temperatury niższe od minimalnych i wyższe od maksymalnych nie muszą być dla drobnoustrojów zabójcze, zawsze jednak hamują ich rozwój. Punkty kardynalne nie zawsze oznaczają ściśle określonej temperatury. Może to być pewien (zwykle wąski) zakres temperatur, zależny od innych czynników, np. od odczynu podłoża. Temperatura inkubacji hodowli zwykle pokrywa się z temperaturą optymalną dla danego drobnoustroju. Aby zachować właściwą temperaturę podczas rozwoju hodowli, prowadzi się ją w tzw. cieplarkach, czyli szafkach zaopatrzonych w urządzenie termostatowe umożliwiające nastawienie odpowiedniej temperatury i utrzymanie jej.
Punkty kardynalne są podstawą do podziału mikroorganizmów na trzy podstawowe grupy:
psychrofilne (zimnolubne), o temperaturze optymalnej ok. 200C (minimum ok. -100C, maksimum ok. 300C),
mezofilne (średniotemperaturowe), o optimum w 370C (minimum 150C, maksimum 450C),
termofilne (ciepłolubne), o optimum w 550C (minimum 300C, maksimum 750C).
Psychrofilami jest większość drobnoustrojów żyjących w środowisku wodnym i glebowym.
Mezofilami są głównie drobnoustroje żyjące w ciele (i na ciele) zwierząt stałocieplnych (ptaki i ssaki). Są wśród nich zarówno gatunki chorobotwórcze, jak i niechorobotwórcze (saprofityczne) tworzące tzw. mikroflorę organizmu.
Do mikroorganizmów termofilnych należą głównie gramdodatnie laseczki i ziarenkowce. Występują one np. w fermentujących resztkach roślinnych, np. w oborniku, kompoście, stogach siana, w nawozie, gorących źródłach itp. Istnieje też grupa mikroorganizmów prokariotycznych zwana archeonami (do niedawna zaliczana do bakterii), która żyje w warunkach ekstremalnych, gdzie temperatura przekracza 1000C. Chodzi o tzw. kominy termalne na dnie oceanów. Drobnoustroje żyjące w tak wysokich temperaturach określa się mianem ekstremalnych termofili.
Odczyn
Podobnie jak w przypadku temperatury (i innych czynników środowiska), tu również wyróżnia się dla każdego drobnoustroju wartość optymalną odczynu, jego minimum i maksimum. Odpowiednie stężenie jonów wodorowych (którego ujemny logarytm oznacza się jako pH) ma poważny wpływ na rozwój komórek. Większość bakterii preferuje odczyn obojętny lub lekko zasadowy (pH ok. 7 - 7,5), grzyby natomiast lepiej rosną w środowisku kwaśnym (pH ok. 5,2 - 5,6). W trakcie hodowli, jej odczyn dość szybko się zmienia, z powodu powstawania produktów przemiany materii. Aby utrzymać optymalny odczyn, pożywki przygotowuje się na bazie odpowiednich buforów
Natlenienie
Pod względem stosunku do tlenu mikroorganizmy dzieli się na:
Bezwzględne tlenowce (bezwzględne aeroby),
Bezwzględne beztlenowce (bezwzględne anaeroby),
Względne beztlenowce (względne anaeroby),
Mikroaerofile.
Bezwzględne tlenowce, jak sugeruje ich nazwa, wymagają warunków tlenowych w stężeniu atmosferycznym (20%). W hodowli nie napowietrzanej na pożywce płynnej (np. bulionie), rosną tylko na powierzchni, w postaci kożuszka, pozostawiając pożywkę przezroczystą (np. laseczki z rodzaju Bacillus i wiele grzybów). W głębi pożywki mogą one rosnąć jedynie w warunkach napowietrzania.
Bezwzględne beztlenowce nie tolerują tlenu, ponieważ w jego obecności powstaje w procesach metabolizmu nadtlenek wodoru (H2O2), związek silnie utleniający, a drobnoustroje te nie wykazują aktywności katalazowej (katalaza jest enzymem rozkładającym H2O2). Przykładem bezwzględnych beztlenowców są niektóre laseczki z rodzaju Clostridium, np. laseczka tężca (C. tetani). Hodowla takich bakterii wymaga usunięcia tlenu z pożywki, co można osiągnąć różnymi metodami (patrz niżej).
Względne beztlenowce mogą rozwijać się zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. Przykładem może być pałeczka okrężnicy (Escherichia coli), pospolity mieszkaniec jelita grubego człowieka. W nie napowietrzanej hodowli bulionowej rośnie ona w całej objętości pożywki (a więc w miejscach o różnym stopniu natlenienia) tworząc jednolite zmętnienie. Ten typ wzrostu określa się jako dyfuzyjny.
Mikroaerofile to drobnoustroje wymagające do wzrostu tlenu, ale w niewielkim stężeniu, dlatego w nie napowietrzanej hodowli na pożywce płynnej tworzą zmętnienie tylko na pewnej głębokości pożywki, gdzie stężenie tlenu jest odpowiednio niskie. Przykładem mogą być bakterie fermentacji mlekowej z rodzaju Lactobacillus.
Aby zapewnić dobre natlenienie hodowli, stosuje się wytrząsanie (w hodowlach płynnych), doprowadzanie powietrza za pomocą pompki membranowej (w każdym typie hodowli) oraz zapewnienie możliwie dużych powierzchni wymiany gazów (szczególnie w przypadku hodowli na podłożach stałych).
Warunki beztlenowe w hodowli można osiągnąć różnymi metodami, m.in. przez:
zagotowanie pożywki bezpośrednio przed posiewem,
wprowadzenie na powierzchnię pożywki płynnej warstwy sterylnej parafiny,
posiew wgłębny w podłożu zestalonym,
dodanie do pożywki związków redukujących, które obniżają potencjał oksydacyjno-redukcyjny (kwas askorbinowy, tioglikolan sodu),
hodowlę w jednym naczyniu hodowlanym (szczelnie zamkniętym) tlenowców i beztlenowców (tlenowce zużywają tlen i stwarzają warunki beztlenowe),
hodowlę w tzw. anerostatach, w których powietrze jest usuwane np. pompką wodną, a w jego miejsce wprowadzany gaz obojętny, np. azot,
Ciśnienie osmotyczne
Większość drobnoustrojów może rosnąć tylko przy określonym stężeniu soli, w roztworze izotonicznym (stężenie soli na zewnątrz i wewnątrz komórki są sobie równe). Komórki w roztworze hipotonicznym, gdy stężenie soli na zewnątrz komórki jest mniejsze i woda ma tendencje do wnikania do wnętrza, mogą ulec pęknięciu (dzięki ścianie komórkowej udaje im się jednak wytrzymać określony napór wody). Z tego powodu do rozcieńczania prób w mikrobiologii nie stosuje się wody destylowanej, lecz roztwór fizjologiczny będący 0,85% roztworem NaCl. W roztworach hipertonicznych (stężenie na zewnątrz jest większe) przeżywalność komórek zależy od zdolności do przeciwstawiania się wypływowi wody i wysuszeniu. Drobnoustroje zdolne do wytrzymywania większych stężeń soli (do ok. 15%) określane są mianem osmotolerancyjnych (np. gronkowce), natomiast te, które wytrzymują jeszcze wyższe stężenia to tzw. osmofile lub halofile (niektóre archeony).
Rodzaje hodowli.
Hodowle dzieli się zwykle na:
statyczne (okresowe),
ciągłe,
zsynchronizowane.
W hodowli statycznej mikroorganizmy posiane do pożywki rosną i rozmnażają się do czasu wyczerpania się składników pokarmowych lub (i) nagromadzenia się toksycznych produktów przemiany materii. W tego typu hodowli rozwój populacji bakterii przebiega w kilku charakterystycznych fazach, które można zobrazować na wykresie w postaci tzw. krzywej wzrostu:
faza zastoju,
faza wzrostu logarytmicznego (wykładniczego),
faza stacjonarna,
faza zamierania.
W fazie zastoju w zaszczepionych komórkach (inokulum) zachodzą procesy adaptacji polegające na syntezie potrzebnych enzymów, replikacji DNA, syntezie białek i w efekcie komórki zwiększają swoje rozmiary. Długość tej fazy zależy od podobieństwa warunków hodowli poprzedniej (z której pochodzi inokulum) do warunków panujących w nowej hodowli. Im jest ono większe, tym faza jest krótsza.
W fazie wzrostu logarytmicznego komórki zaczynają się dzielić. Sygnałem do podziałów jest osiągnięcie przez komórki odpowiedniej długości. Każda komórka dzieli się na dwie. Po określonym czasie wzrostu powstałe komórki znowu dzielą się na dwie, stąd liczbę powstałych komórek (czyli wzrost populacji) określa wzór 2n, gdzie n - to liczba podziałów, która jest równoznaczna z liczbą pokoleń. Czas między dwoma kolejnymi podziałami, to tzw. czas generacji lub wiek osobniczy. Zależy on od warunków hodowli i od cech gatunkowych drobnoustroju. W konkretnej hodowli jest on więc stały. Jeśli liczba komórek w inokulum wynosi N0, to powstała liczba komórek N po n pokoleniach wyniesie N = N0 x 2n. Liczba bakterii podwaja się co każdy okres generacji, rośnie więc wykładniczo z upływem czasu. Do czasu hodowli proporcjonalny jest więc logarytm liczby bakterii, a nie sama ich liczba. Stąd nazwa - faza logarytmiczna.
W fazie stacjonarnej obserwuje się spadek przyrostu liczby bakterii, w wyniku zamierania części komórek z powodu wyczerpywania się składników pokarmowych, tlenu i wytwarzania produktów przemiany materii. Zamieranie to jest w pewnej równowadze z dzieleniem się innych komórek
Z czasem komórek zamierających jest więcej i dochodzi do spadku ogólnej liczby komórek - hodowla się przerzedza i z czasem zamiera.
Jednak opisana sekwencja zdarzeń w hodowli może być inna. Jeśli tylko zapewni się usuwanie zużytego podłoża i zastępowanie go świeżym, to możliwe jest utrzymywanie fazy wzrostu logarytmicznego praktycznie w nieskończoność. Na tym właśnie polega hodowla ciągła. Jest więc ona, w przeciwieństwie do hodowli statycznej, układem otwartym, z ciągłym przepływem pożywki (zużytej i świeżej). Prowadzi się ją w tzw. chemostatach, umożliwiających kontrolowanie wzrostu komórek za pomocą dozowania odpowiednich ilości pożywki i regulowania szybkości przepływu. Dzięki temu możliwe jest uzyskanie stanu równowagi, w którym zagęszczenie komórek jest stałe. Ma to duże znaczenie w badaniach procesów fizjologicznych drobnoustrojów, kiedy niezbędne są warunki stabilne. Hodowle ciągłe są wykorzystywane m.in. w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym, do produkcji określonych substancji (np. kwasu octowego, antybiotyków) i biomasy (np. drożdży). Hodowle w procesach produkcyjnych prowadzi się w bioreaktorach (fermentorach). Rodzajem hodowli ciągłej jest również biologiczna oczyszczalnia ścieków, w której hoduje się bakterie (jako tzw. osad czynny) na bazie pożywki, jaką stanowią ciągle dopływające ścieki.
Hodowla zsynchronizowana to hodowla, w której komórki dzielą się równocześnie (czyli synchronicznie), w przeciwieństwie do innych hodowli, gdzie podziały komórek są nieskoordynowane. Dzięki jednoczesności podziałów, zmiany w hodowli synchronicznej są odzwierciedleniem (zwielokrotnieniem) zmian w pojedynczej komórce. Umożliwia to badanie przemian zachodzących w cyklu życiowym komórki, zwykle nieuchwytnych ze względu na zbyt małą czułość metod badawczych. Zsynchronizowanie podziałów można osiągnąć wieloma metodami, m.in. przez szok wywołany niską temperaturą. Bakterie przenosi się na ok. 15 - 60 min. do temperatury dużo niższej od optymalnej. W tych warunkach dochodzi do zrównania stanu fizjologicznego komórek, które przeniesione do temperatury optymalnej, równocześnie zaczynają podziały komórkowe. Osiągnięta synchronizacja nie jest trwała i, jeśli nie jest utrzymywana, szybko spontanicznie zanika.