 | Pobierz cały dokument techniki.fluorescencji.w.analizie.doc Rozmiar 77 KB |
Techniki fluorescencyjne w analizie związków biologicznie czynnych
Większa selektywność i specyficzność analiz
Bardzo niska granica oznaczalności ( ilość związku)
Bardzo niska granica wykrywalności ppb ppt 10 -12g (pg)
Czułość - reakcja danej metody na zmianę ilości związku (substancji) - generuje się duża zmiana w emisji- 3-6 razy większa niż w absorpcjometrii
Fluorofor jest częścią cząsteczki, która odpowiada za jej fluorescencję. Najczęściej jest to grupa funkcyjna, zdolna do absorpcji energii o określonej długości fali, a później do wyemitowania innej długości fali (ściśle określonej). Ilość energii oraz długość fali emitowanej zależy od właściwości fluoroforu, ale również od środowiska chemicznego w jakim on działa (np. pH, czy siła jonowa). Stosuje się zestawy fluoroforów.
Fluorofory jako znaczniki |
Ex |
Em |
Hydroksykumaryna Izotiocyjanian fluoresceiny(FITC) Tetrametylorodamina (TRITC) Indokarbocyjanina (Cy5) |
325 495 547 625-650 |
386 519 572 670 |
Fluorofory wiążące się z kwasami nukleinowymi |
Ex |
Em |
|
Hoechst 33342 SYTOX Green Chromomycin A3 Arcidine Orange Dapi |
343 504 445 503 345 |
483 523 573 530-640 465 |
AT-selektywny DNA CG-selektywny DNA i RNA AT-selektywny |
Znaczniki fluorescencyjne- syntetyczne barwniki fluorescencyjne (fluorofory), charakteryzujące się dużą wydajnością kwantową fluorescencji, które wykazują reaktywność względem określonych grup (aminowej, tiolowej). Daje to możliwość znakowania niefluoryzujących związków (leków, białek, DNA) w celu ich detekcji i oznaczenia technikami fluorescencyjnymi.
Sondy fluorescencyjne:
Jest fluoroforem, który lokalizuje się w specyficznym rejonie biologicznego obiektu (np. błony komórkowe, mitochondria, jądro) lub odpowiada na specyficzny czynnik stymulujący
Sondy mogą lokalizować się w określonym regionie komórki (np. błony komórkowe, mitochondria, jądra) lub wiązać się do określonych sekwencji wyizolowanego DNA (np. podczas procesu sekwencjonowania lub hybrydyzacji DNA)
Mogą odpowiadać na działanie specyficznych enzymów
Rolę sony mogą pełnić:
znaczniki fluorescencyjne charakteryzujące się wysoką wydajnością kwantową fluorescencji np. ANS (anilino-naftaleno-sulfonian), TNS (tolueno-naftaleno-sulfonian) czy chlorek dansylu
fluoryzujące barwniki związane z oligonukleotydami np. sondy hybrydyzacyjne do ilościowego PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym)
 | Pobierz cały dokument techniki.fluorescencji.w.analizie.doc rozmiar 77 KB |