Metody barwienia i morfologia komórki bakteryjnej

Budowa komórki bakteryjnej

1. struktury podstawowe:

• ściana komórkowa

• błona cytoplazmatyczna

• cytoplazma

• rybosomy

• nukleoid

2. struktury dodatkowe:

• otoczki

• rzęski

• fimbrie

• przetrwalniki

• wtręty komórkowe

• plazmidy

STAŁE ELEMENTY KOMÓRKI BAKTERYJNEJ

ŚCIANA KOMÓRKOWA

Zbudowana jest z peptydoglikanu (mureiny). Cząsteczka peptydoglikanu jest zbudowana z długich łańcuchów polisacharydowych, które łączą się w sieć za pomocą mostków peptydowych.

Każdy łańcuch polisacharydowy zbudowany jest z dwucukrów:

→ N-acetyloglukozaminy

→ Kwasu N-acetylomuraminowego (występuje wyłącznie u organizmów prokariotycznych).

Ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej dzielimy bakterie na Gram - dodatnie i Gram - ujemne.

Bakterie gram-dodatnie mają wielowarstwową ścianę komórkową.

• Wszystkich warstw jest zwykle ok. 40 i są one ze sobą połączone poprzecznymi wiązaniami.

• Grubość takiej ściany komórkowej wynosi 20-80 nm.

• Zbudowana jest z mureiny, kwasów tejchojowych i tejchuronowych oraz kwasów lipotejchojowych.

• Składa się w 60-100% z peptydoglikanu tworzącego trójwymiarową sieć.

• Kwasy tejchojowe i tejchuronowe przechodzą w poprzek ściany komórkowej - są "wplecione" w mureinę. Podobnie rozmieszczone są kwasy lipotejchojowe, zawierają one jednak dodatkowy komponent tłuszczowy, który zakotwicza je w błonie komórkowej bakterii.

Ściana komórkowa bakterii gram-ujemnych zbudowana jest z pojedynczej warstwy mureiny, której towarzyszą dodatkowe związki chemiczne.

• Grubość ściany wynosi 2-10 nm i nie stwierdza się w niej obecności kwasów tejchojowych.

• Ściana komórkowa jest otoczona dodatkową strukturą, tzw. błoną zewnętrzną. Zatem praktycznie jedyną funkcją ściany komórek gram-ujemnych jest zapobieganie cytolizie (plazmolizie) wywołanej zmianami ciśnienia osmotycznego.

Błonę zewnętrzną tworzą: lipopolisacharyd, fosfolipidy i białka.

• Lipopolisacharyd (LPS) - endotoksyna:

• Efekty biologiczne działania endotoksyn mogą być wielokierunkowe i zróżnicowane.

• Heteropolimer zbudowany z trzech składowych:

• Lipid A

• Oligocukier rdzeniowy - podobny u wszystkich bakterii Gram - ujemnych, często nazywany antygenem wspólnym (CA - common antigen) lub antygenem Kunina

• Antygen somatyczny (antygen O): leży najbardziej zewnętrznie, składa się z podjednostek oligocukrowych.

BŁONA CYTOPLAZMATYCZNA

• Wykazuje typową dla wszystkich błon elementarnych strukturę trójwarstwową i zbudowana jest z lipidów (20-35%) i białek (50-75%).

NUKLEOID

• Obszar komórki prokariotycznej będący odpowiednikiem jądra komórkowego u Eukaryota.

• Nie jest oddzielony od cytoplazmy otoczką jądrową.

• Zawiera genofor (chromosom bakteryjny), czyli pojedynczą, kolistą cząsteczkę dwuniciowego DNA.

• Niektóre funkcje organizmu (np. oporność na antybiotyki, synteza bakteriocyn) są kodowane przez plazmidy - samoreplikujące się, zamknięte, koliste cząsteczki dwuniciowego DNA.

• Nukleoid wraz z plazmidami zawiera pełną informację genetyczną komórki.

CYTOPLAZMA

• Wodny roztwór związków wielkocząsteczkowych, soli mineralnych, cukrów prostych, aminokwasów, kwasów tłuszczowych i związków wysokoenergetycznych o charakterze koloidu, w którym zawieszone są biologicznie czynne struktury: nukleoid, plazmidy, rybosomy, materiał zapasowy (ziarnistości, wtręty, kryształki, kropelki).

RYBOSOMY

• Rybosomy u Prokaryota są mniejsze niż u Eukaryota, mają niższą masę cząsteczkową i stałą sedymentacji Svedberga, wynoszącą 70S.

ZMIENNE ELEMENTY KOMÓRKI BAKTERYJNEJ

Otoczki

• Chronią bakterie przed wyschnięciem, ułatwiają adhezję, chronią przed reakcją obronną zakażanego organizmu, mogą być czynnikiem zjadliwości.

• Można je uwidocznić pod mikroskopem świetlnym stosując barwniki nie przechodzące przez materiał otoczkowy, np. nigrozynę, czerwień Kongo, tusz chiński. W technice barwienia negatywnego na ciemnym tle preparatu pojawiają się jasne otoczki.

Rzęski

• Rzęski są to wyrostki o średnicy 12-18 nm i długości do 20 μm.

• Za pomocą ciałka bazalnego są zaczepione jednym końcem w błonie cytoplazmatycznej.

• Umiejscowienie i liczba rzęsek jest dla bakterii cechą charakterystyczną i ma znaczenie taksonomiczne.

• Obecność i ułożenie rzęsek na komórce:

• ditrychalne (dwurzęse)

• monotrychalne (jednorzęse)

• lophotrychalne (czuborzęse)

• jednobiegunowe

• dwubiegunowe

• perytrychalne (wkołorzęse)

Fimbrie i pile

• Niektóre bakterie gram-ujemne mogą wytwarzać nitkowate, zakotwiczone w cytoplazmie wyrostki - fimbrie.

• Są to długie, cienkie, proste nici o średnicy 3-25 nm, długości do 12 μm.

• Grubsze wyrostki, zwane też pilami płciowymi (pilami typu F), służą podczas koniugacji do przenoszenia DNA.

Przetrwalniki (endospory)

• Niektóre gatunki bakterii mają zdolność wytwarzania przetrwalników (rodzaje: Bacillus, Clostridium)

• W razie występowania niekorzystnych warunków środowiska rozpoczyna się proces sporulacji, w którym następuje zagęszczenie protoplazmy, ustają procesy metaboliczne, zawartość przetrwalnika jest otaczana grubą ścianą.

• Przetrwalniki są bardzo odporne na działanie niekorzystnych czynników fizycznych i chemicznych

• Po zaistnieniu korzystnych warunków środowiskowych rozpoczyna się kiełkowanie (germinacja) przetrwalników.

• Ułożenie przetrwalników:

• Centralne

• Paracentralne

• Subterminalne

• Termialne

Opis komórki bakteryjnej (obraz mikroskopowy):

a) wynik barwienia

b) wielkość

c) układ

d) kształt komórki bakteryjnej

e) obecność i ułożenie rzęsek

f) obecność otoczki

g) obecność ciał zapasowych

h) obecność, kształt, wielkość, ułożenie przetrwalników

Wynik barwienia - metody barwienia

Stosowane barwniki możemy podzielić na:

1. Kwaśne - eozyna, fuksyna kwaśna,

2. Zasadowe - błękit metylenowy, fuksyna zasadowa.

Barwienie ma na celu:

1. umożliwić obejrzenie układu przestrzennego morfologii i anatomii komórek

2. wykazać obecność bakterii w badanym preparacie

Przygotowanie preparatu z hodowli:

1. Przygotowanie rozmazu na szkiełku podstawowym - pobrać jedną kolonię ezą i rozetrzeć na szkiełku.

2. Połączyć z kroplą 0,9% NaCl

3. Pozostawić do wyschnięcia

4. Utrwalić w płomieniu palnika

Metody barwienia:

• Proste (jeden barwnik):

• Pozytywne (barwią się komórki bakteryjne): metoda Löfflera,

• Negatywne (barwi się tło): barwienie nigrozyną lub tuszem chińskim.

• Złożone (kilka barwników):

• Pozytywne (j. w. ): metoda Neissera, metoda Grama, metoda Waysona (do barwienia preparatów bezpośrednich),

• Pozytywno - negatywne (barwią się elementy komórek bakteryjnych i tło - metoda uwidaczniania otoczek): barwienie otoczek wg Burri - Ginsa, barwienie przetrwalników wg Dornera.

Barwienie metodą Grama:

Fiolet krystaliczny - 2-3 min

Spłukać wodą

Płyn Lugola - 1-2 min

Spłukać wodą

Odbarwiacz

Spłukać wodą

Fuksyna zasadowa - 0,5 min

Spłukać wodą

Wynik barwienia:

Gram dodatnie - fioletowe

Gram ujemne - czerwone

Gram chwiejne - czerwono- fioletowe (np. Corynebacterium)

1

---