Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa
Im. Prezydenta Stanisława Wojciechowskiego w Kaliszu
Instytut Politechniczny - Inżynieria Środowiska
Specjalizacja - Wentylacja i klimatyzacja
Metody oznaczania mikroorganizmów
w powietrzu
Wykonała:
Marta Nasidłowska
VI semestr
Prowadzący zajęcia:
Mgr Barbara Sencio
Za pośrednictwem powietrza roznoszone są liczne drobnoustroje chorobotwórcze, znajdujące się w aerozolu kropelek powstających podczas kaszlu czy kichania. Do zakażenia może dojść m.in. przez powietrze zakażone wysuszonymi zarazkami przyczepionymi do cząsteczek kurzu lub przez zawieszone w nim „kropelki” (zakażenie kropelkowe).
Oprócz flory patogennej w powietrzu atmosferycznym występują także obficie mikroorganizmy saprofityczne. Wykryte w powietrzu grzyby należą głównie do saprobów, ale niektóre z nich mogą stanowić florę patogenną.
Powietrze jest środowiskiem nieprzyjaznym dla życia mikroorganizmów. W odróżnieniu od gleby i wody jest ono ośrodkiem okresowego przebywania mikroorganizmów, w którym nie mogą one dzielić się i rosnąć, lecz zachowują niestety swój potencjał infekcyjny.
Zanieczyszczenia mikrobiologiczne są ważnym problemem zdrowotnym i sanitarnym. Bakterie obecne w powietrzu mogą być bowiem źródłem znacznych ilości gazowych zanieczyszczeń, takich jak np. metan, tlenek węgla, tlenki azotu, amoniak, etylen czy siarkowodór. Metan jak wiadomo jest drugim po dwutlenku węgla gazem cieplarnianym odpowiedzialnym za tzw. efekt cieplarniany. Natomiast siarkowodór produkowany w specyficznych środowiskach przez bakterie może dostarczać do atmosfery więcej siarki niż dwutlenek tego pierwiastka wydalany przez działalność przemysłową.
Bioaerozole odgrywać znaczącą rolę w zanieczyszczeniu powietrza wewnątrz pomieszczeń, ponieważ mogą one być zjadliwe lub wywoływać reakcje alergiczne.
Powietrza w pomieszczeniach zawiera złożoną mieszaniną bioaerozole takich jak bakterie, grzyby, wirusy, komórek bakteryjnych i komórkowych
fragmenty, zarodniki grzybów i produktów ubocznych metabolizmu drobnoustrojów i innych cząsteczek biologicznych, np. pyłów,
dymu tytoniowego, gotowania generowanych cząsteczek i cząstek spalin pojazdów silnikowych. Głównymi źródłami
bioaerozole w powietrza w pomieszczeniach są ludzie się kryty materiałów, np. tkanin lub tapety, jak również na zewnątrz
aerozoli. Stężenia bioaerozole domowych i biurowych są omówione w pracy wraz z
proponuje przepisami prawa.
Wentylacja zajmuje się poprawą stanu oraz składu powietrza w pomieszczeniach, w których stale przebywają ludzie.
Klimatyzacja jest niczym innym jak doskonalszą formą wentylacji mechanicznej nawiewnej i ma na celu również utrzymanie w pomieszczeniu warunków klimatycznych sprzyjających dobremu samopoczuciu.
Klimatyzacja przemysłowa stosowana jest najczęściej w zakładach przeróbki materiałów higroskopijnych.
Klimatyzacja dla pomieszczeń jest przeznaczona głównie dla ludzi, którzy nie wykonują ciężkiej i fizycznej pracy lub lekkiej.
Wśród zanieczyszczeń powietrza można wyróżnić:
*Pyły- substancja mineralna, pozostałość procesu spalania, a także ścierania lub kruszenia substancji stałych takich jak minerały nieorganiczne, organiczne oraz metale. Pod pojęciem pyłu zgodnie z Polską Normą (PN-64/Z-01001) rozumiemy „fazę stałą układu dwufazowego ciało stałe-gaz lub gaz-ciało stałe, jeżeli stopień rozdrobnienia fazy stałej jest tak duży, że w nieruchomym powietrzu o ciśnieniu 1013,25 hPa i temperaturze 20 ziarna ciała stałego, na które działa tylko siła ciążenia, po bardzo krótkim okresie przyspieszenia, wskutek oporu przepływu ośrodka, będą opadały ze stałą prędkością mniejszą niż 500 cm/s lub będą wykonywały ruchy Browna”.
*Gazy- stan skupienia materii, w którym ciało fizyczne łatwo zmienia kształt i zajmuje całą dostępną mu przestrzeń. Właściwości te wynikają z własności cząsteczek, które w fazie gazowej mają pełną swobodę ruchu. Wszystkie one cały czas przemieszczają się w przestrzeni zajmowanej przez gaz i nigdy nie zatrzymują się w jednym miejscu.
*Drobnoustroje chorobotwórcze- śa to min. bakterie i wirusy. Poza organizmem odgrywają ważną rolę w przenoszeniu się zarazków ze źródła zakażenia na zdrowy wyższy organizm. Rozróżniamy: kontakt bezpośredni, w którym zarazek przenosi się na zdrowy ustrój w chwili zetknięcia się z tkankami zdrowego osobnika, w ten sposób np.: przenoszą się choroby weneryczne, wścieklizna, zakażenie łożyskowe (wrodzone), pochwowe, oraz kontakt pośredni, który zachodzi wówczas, jeśli pomiędzy źródło zakażenia a człowieka ulegającego zakażeniu włącza się jedno lub kilka ogniw pośredniczących.
*Inne związki chemiczne.
Przykłady chorób:
* Legionelloza-choroba legionistów (inaczej legioneloza) - to ciężka zakaźna choroba dróg oddechowych wywołana zakażeniem Gram-ujemną bakterią Legionella pneumophila. Objawy: okres inkubacji 2 - 10 dni, gorączka, dreszcze,uczucie osłabienia, złe samopoczucie, senność ,jadłowstręt ,bóle głowy i bóle mięśniowe ,biegunka w około 50% przypadków, nudności i wymioty w 10 - 20%, kaszel suchy, w późniejszym okresie wilgotny , ból w klatce piersiowej o charakterze opłucnowym ,krwioplucie,bradykardia u ponad 60% chorych oraz obniżenie ciśnienia tętniczego krwi.
* Gruźlica- powszechna i potencjalnie śmiertelna choroba zakaźna, wywoływana przez prątka gruźlicy (Mycobacterium tuberculosis). Gruźlica dotyczy najczęściej płuc (gruźlica płucna) lecz również może atakować ośrodkowy układ nerwowy, układ limfatyczny, naczynia krwionośne, układ kostno-stawowy, moczowo-płciowy oraz skórę.
* Grzybica- grupa wysoce zaraźliwych chorób zakaźnych ludzi i zwierząt wywołana przez mikroskopijne grzyby (około 200 gat. z 250 000 opisanych).Objawy W przypadku grzybic skóry są to: świąd, łuszczenie się skóry, miejscowe zaczerwienie. W przypadku grzybic głębokich: objawy narządowe, biegunka.Zapobiegać można na j higiene osobistą, tj. dokładne wycieranie fałdów między palcami po zajęciach na basenie; używanie własnego ręcznika oraz higiena ubrań. W przypadku grzybicy pachwin, pośrednie znaczenie ma także otyłość.
* Alergia (popularnie stosowane synonimy uczulenie, nadwrażliwość) - patologiczna, jakościowo zmieniona odpowiedź tkanek na alergen, polegająca na reakcji immunologicznej związanej z powstaniem swoistych przeciwciał, które po związaniu z antygenem doprowadzają do uwolnienia różnych substancji - mediatorów stanu zapalnego. Może się objawiać łagodnie, jak w przypadku kataru czy łzawienia, aż po zagrażający życiu wstrząs anafilaktyczny i śmierć.
Metody mikroskopowe:
Wykonanie tego typu badań wymaga przepuszczenia powietrza przez fi ltr membranowy, na którym osadzają się mikroorganizmy. Zastosowanie tutaj znajduje także szkiełko powleczone substancją lepką, np. wazeliną. Wyłapane mikroorganizmy barwi się, a następnie poddaje zliczaniu pod mikroskopem. Metoda ta umożliwia wykrywanie w powietrzu nie tylko żywych, ale również martwych mikroorganizmów, w tym drobnoustrojów trudno wzrastających na pożywkach. Badanie pod mikroskopem umożliwia zaobserwowanie szerokiego spektrum zanieczyszczeń powietrza, zarówno zanieczyszczeń biologicznych, np. pyłków roślin, czy roztoczy, jak też zanieczyszczeń pyłowych. Za wadę tej metody uznaje się trudności w identyfi kacji gatunkowej mikroorganizmów.
Metody hodowlane
Badania tego typu polegają na zebraniu mikroorganizmów zawartych w powietrzu na płytce z naniesioną pożywką. Następnie tak zebrane zarodki poddaje się inkubacji i zlicza wyrosłe kolonie. Kolonia może wyrosnąć z jednej lub z wielu połączonych komórek, co oznacza, że w powietrzu może znajdować się więcej mikroorganizmów niż wskazuje na to wynik wyrażony w JTK/m3. Wadą tej metody jest możliwość wykrywania komórek jedynie żywych i zdolnych do wzrostu na danej pożywce.
Metoda sedymentacyjna
Najstarszą, stosowaną jeszcze powszechnie w szpitalach metodą kontroli czystości mikrobiologicznej powietrza w salach operacyjnych jest metoda sedymentacji Kocha. W metodzie tej otwarte płytki z podłożem stałym należy pozostawić na 30 minut na wysokości 1 metra od podłogi. Do pobrania próbek polecane są płytki Petriego (rys.2) zawierające podłoża wzbogacone, np. Tryptic Soy Agar - TSA, TSA z neutralizatorami, w zależności od potrzeb także podłoża wybiórcze np. Sabouraud. Zarodki powinny być inkubowane przez 48 godzin w temperaturze 37°C (TSA) lub przez 10 dni w temperaturze 28°C (Sabouraud). Po tym czasie wyhodowane kolonie należy zliczyć i zidentyfikować ich szczepy.
Metoda zderzeniowa polega na przepuszczeniu próbki powietrza przez szczeliny lub otwory, nadające mu prędkość wystarczającą do wydzielenia zanieczyszczeń podczas uderzenia o powierzchnię pożywki znajdującej się na specjalnej, dostosowanej do miernika płytce podobnej do płytki Petriego, np. płytce typu Rodac. Następnie zainfekowaną pożywkę poddaje się inkubacji i zlicza liczbę kolonii. Wadą tej metody jest możliwość zarastania pożywek w przypadku silnego zanieczyszczenia powietrza, a także spadek żywotności drobnoustrojów spowodowany stresem środowiskowym w wyniku nagłego uderzenia mikroorganizmu o pożywkę. Zarastanie pożywki może być również wynikiem nieodpowiednio przygotowanego podłoża, np. zbyt słabe osuszenie płytki i występowanie kropel wody są przyczynami rozlewania się mikroorganizmów na pożywce, w wyniku czego niemożliwe staje się późniejsze zliczanie kolonii. Podczas pobierania próbek, podobnie jak w metodzie filtracyjnej, przy dłuższej ekspozycji może dojść do wysychania podłoża, przez co zmniejsza się zdolność podłoża do zatrzymywania cząstek oraz następuje wysuszenie zebranych zarodków. Metoda ta nadaje się do kontroli powietrza na zawartość wirusów. Po wypłukaniu i zniszczeniu chloroformem innych mikroorganizmów, wyizolowane wirusy wprowadza się do hodowli komórkowych.
Metoda filtracyjna polega na przepuszczeniu próbki powietrza przez filtr, na którym zatrzymują się zanieczyszczenia mikrobiologiczne. Po przeniesieniu na powierzchnię pożywnego agaru, poddaje się je inkubacji i zliczaniu liczby kolonii. Należy pamiętać, że niewłaściwy wybór urządzenia fi ltrującego lub wydłużenie ekspozycji może wpłynąć na zmniejszenie żywotności niektórych mikroorganizmów wskutek ich wysuszenia. Metodę tę również stosuje się w metodach mikroskopowych. Rutynowo znajduje ona zastosowanie w wykrywaniu endotoksyn w powietrzu.
Wykrywanie wirusów, endotoksyn, toksyn i alergenów w powietrzu:
Badanie na zawartość wirusów w powietrzu różni się zasadniczo od ww. metod stosowanych do badania bakterii i grzybów. Przede wszystkim niezbędne jest pobranie bardzo dużej ilości powietrza (powyżej 1000 dm3) [2], gdyż wirusy występują w nim niezbyt licznie, a znaczna ich część jest niezdolna do wywołania infekcji. Ilość pobieranego powietrza jest przynajmniej o rząd wielkości większa, niż ilość pobieranego powietrza w przypadku wychwytywania bakterii. Ze względu na fakt, że wirusy mogą wzrastać jedynie w żywych komórkach, niezbędne jest zastosowanie hodowli tkankowych. Do tego celu najczęściej używa się tchawicy człowieka lub nerki małpy. Po wniknięciu do komórek wirusy namnażają się w nich, a po ich zniszczeniu przenoszą na sąsiednie, w wyniku czego pojawiają się tzw. łysinki (ang. plaque) na tle niezmienionej warstwy komórek. Liczbę wirusów zawartych w powietrzu podaje się jako liczbę jednostek tworzących łysinki, w skrócie pfu/m3 (plaque forming units).