POŻYWKI MIKROBIOLOGICZNE służą do hodowli drobnoustrojów w warunkach sztucznych. Stosuje się je do namnażania, izolacji, różnicowania i identyfikacji oraz oznaczania cech fizjologicznych i biochem. Każde podłoże powinno zawierać odpowiednią ilość subst odżywczych, czynników wzrostowych, wody, tlenu, muszą posiadać właściwe pH i temp.
PODZIAŁ POŻYWEK ZE WZGLĘDU NA:
-dobór składników, -zawartość skł odżywczych, -cel hodowli, -konsystencję
1. Podział ze względu na dobór składników
-naturalne - przygotowane ze skł nat, np. mleko, serwatka, bulion, brzeczka, wyciąg z ziemniaków, drożdży
-półsyntetyczne - wykonane z syntetycznych zw chem i skł nat, np. mleko z lakmusem, czy agar ziemniaczany z tiaminą
- syntetyczne - składające się z subst syntetycznych.
2. Ze wzgl na zawartość skł odżywczych podłoża dzielimy na:
-podstawowe - stanowią bazę do przygotowania wszystkich innych pożywek, np. bulion, brzeczka
-wzbogacone - z dodatkiem czynników wzrostowych, np. bulin z ekstraktem drożdżowym i glukozą.
3. Specjalne grupy podłoży:
-podłoża transportowe - do przenoszenia materiału mikrobiologicznego od pacjęta do laboratorium, jest to zbuforowane podłoże min
4. Zależnie od celów jakie mają spełniać określone pożywki, dzielimy je na:
- namnażające lub namnażająco-wybiórcze - które stosujemy wówczas gdy liczba drobnoustrojów w badanej próbie jest niewielka, np. podłoże płynne z czterotionianem sodu
-izolacyjne - zawierają składniki wybiórcze hamujące wzrost mikroflory niepożądanej, oraz składniki pozwalające na odróżnienie kolonii drobnoustrojów chorobotwórczych od saprofitycznych np. P. Baird-Parkera, Endo i In.
-identyfikacyjne - na które przesiewa się kolonie drobnoustrojów z podłoży izolacyjnych.
5. Pożywki pod względem konsystencji dzielimy na:
-płynne - służą do namnażania lub badania właściwości biochem mikroorganizmów, np. bulion odżywczy
-półpłynne - zawierające 0,1-0,7% agaru, badamy na nich ruch bakterii
-stałe - otrzymuje się je dodając czynnik zestalający, agar lub żelatynę
CECHY POŻYWEK
- zawartość wody min 30%
-zawartość zw będących źródłem węgla i energii: węglowodany (glukoza, laktoza, maltoza, skrobia) zawartość cukru w pożywce 0,5-2%, alkohole i kw org
-zawartość zw będących źródłem azotu: zw nieorg (sole amonowe, azotany), zw org (pepton, żelatyna, krew, aminokwasy). Zawartość zw azotowych w pożywce waha się od 0,5-2%
- zawartość zw min - dodawane w małych ilościach stanowią źródło odpowiednich pierwiastków: fosforu, wapnia, magnezu, potasu
-zawartość innych subst wzrostowych, witamin, zasad purynowych i pirymidynowych.
-odpowiednie pH, żeby zachować odpowiednie stężenie jonów wodorowych do pożywek dodaje się takich zw buforujących jak fosforany, optymalny odczyn większości bakterii waha się od 7,0-7,2, a grzybów od 5,8-6,5
METODY CHODOWLI DROBNOUSTROJÓW:
-hodowle statyczne - polegają na jednorazowym zaszczepieniu kulturą bakteryjną określonej ilości pożywki. Wzrost drobnoustrojów będzie występował do momentu wyczerpania się składników odżywczych, lub zatrucia drobnoustrojów produktami ich własnej przemiany materii
-hodowle ciągłe - polegają na stałym wprowadzeniu do hodowli określonej ilości nowej pożywki i odprowadzeniu takiej samej ilości pożywki zużytej, zapewniają ciągły rozwój drobnoustrojów
- hodowle synchronizowane - synchronizację osiąga się przez selekcję osobników znajdujących się w tym samym stadium rozwojowym.
METODY OTRZYMYWANIA CZYSTYCH KULTUR:
1.Metoda rozcieńczeń - polega na rozcieńczeniu badanej zawiesiny tak żeby w 1cm3 znajdowała się teoretycznie 1 komórka
2.Metoda płytkowa polega na wysiewie odpowiedniego rozcieńczenia zawiesiny drobnoustrojów na podłoże stałe, inkubacji i liczeniu wyrosłych koloni. Najlepsze jest także rozcieńczenie żeby w 1cm3 znajdowało się od 30-300 kolonii.
-metoda posiewu za pomocą ezy
-metoda płytek lanych
-posiew wierzchniowy
3.Metoda kropelkowa
METODY PRZECHOWYWANIA CZYSTYCH KULTUR.
Hodowle drobnoustrojów należy przechowywać w warunkach utrzymujących je w pewnej żywotności i nie mających wpływu na zmiany ich cech charakterystycznych. Hodowle przechowuje się w temp 4C, bez dostępu światła.
Metoda, która pozwala na wieloletnie przechowywanie szczepów jest liofilizacja.
Liofilizacja - polega na wysuszeniu w próżni zamrożonych komórek drobnoustrojów
METODY PRZESZCZEPIEŃ:
W zależności od konsystencji wysiewanego materiału oraz zaszczepionej pożywki wyróżnia się następujące metody przeszczepienia:
1. pożywki płynnej
-na pożywkę płynną (przy użyciu pipety lub ezy)
-na skos (przy użyciu ezy)
-na pożywkę o stałej konsystencji w płytce, metoda wysiewu powierzchniowego oraz metodą wgłębną laną (z użyciem pipety)
2. z pożywki stałej przy użyciu ezy:
-na pożywkę płynną
-na podłoże stałe, skos
-na podłoże o stałej konsystencji umieszczonej na płytce
ROZKŁAD CELULOZY:
-celuloza jest podst skł materiału roślinnego
-składa się z łańcuchów utworzonych z jednostek B-D-glukopiranozy połączonych wiązaniem 1,4-glikozydowym
-liczba reszt glukozowych wacha się od 3500 u bakterii Acetobacter xylinum, 14000 u roślin, do 25000 u zielenicy Walonia
-podstawową jednostką celulozy jest disacharyd celobioza
-duża wytrzymałość mechaniczna oraz nierozpuszczalność celulozy wiąże się z obecnością między- i wewnątrzcząsteczkowych mostków wodnych
-celuloza jest katalizowana przez celulazę
-celuloza jest rozkładana w warunkach tlenowych i beztlenowych
-rozkład celulozy zachodzi szybciej w środowisku o pH obojętnym lub lekko kwaśnym, a także w obecności łatwo dostępnych zw azotu.
Rozkład celulozy w żwaczu zwierząt roślinożernych.:
Zwierzęta roślinożerne posiadają żołądek wielokomorowy (żwacz, czepiec, ksiągi, trawieniec)taka budowa żołądka umożliwia trawienie pokarmu roślinnego, który w prawie 50% składa się z trudno rozkładalnego błonnika. Drobnoustroje symbiotyczne bytujące w żwaczu tych zwierząt posiadają zdolność rozkładu celulozy do zw prostych.
GRUPY MIKROORGANIZMÓW SYMBIOTYCZNYCH:
Pierwotniaki: Diplodinium, Eutodinium
Grzyby: Neocallimastix, Frontalis
Bakterie: Ruminococcus albus, R. flavefaciens, Fibriobacter succinagenes
MIKROORG ROZKŁADAJĄCE CELULOZĘ:
- Grzyby (Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Rhizooctania solani, Trichoderma viride, Fusarium, Alternania, Penicillum
-bakterie właściwe: Cytophaga hutchinsoni, Cytophaga rubra, Cytophaga salmonicolor, Sporocytophaga myxococcoides, Sporocytophaga congregata, cellulomonas, Pseudomonas fluorescens vor cellulosa, Polyangium
-promieniowce - Streptomyces cellulosae, Streptomyces sporangium, Micromonaospora chalcea
znaczenie procesów rozkładu glukozy:
-dzięki aktywności różnych drobnoustrojów ulega zmineralizowaniu subst org, która jest trudno dostępna dla większości mikroorg
-z gosp pkt widzenia jest zarówno korzystna jak i niekorzystna
-w przypadku resztek pożniwnych, czy subst węglowodanowej w oborniku, czy kompoście jest to zjawisko b pożądane
- w skład paszy i żywności pochodzenia roślinnego, rozkład płótna, niszczenie obrazów jest zjawiskiem wysoko niepożądanym.
ROZKŁAD HEMICELULOZ:
-Do hemiceluloza zalicza się wielocukrowce o różnej dł łańcuchów złożonych z cząsteczek pentoz i hektoz. Zalicza się tu ksylan, araban, mannan, glukan, itd.
-hemicelulozy stanowią znaczna część resztek roślinnych (ok. 30%)
-glukozy, pentozy mogą stanowić dł ścian kom u grzybów pleśniowych, a mangany u drożdży, hemicelulozy wchodzą w skład śluzów bakteryjnych, wytważanych często przy rozkładziebłonnika.
-drobnoustroje rozkładające hemicelulozy: Sporocytophaga myxococcoides, Clostridium ssp.
ROZKŁAD SKROBI:
-skrobia stanowi gł subst zapasową roślin
-zw ten jest rozkładany zarówno w warunkach tlenowych jak i beztlenowych
-skrobia wywołuje w roślinach w postaci ziarenek o różnych kształtach i wielkościach. Ziarna te wykazują strukturę warstwową. Składają się z 2 glukanów: amylozy (15-27%) i amylopektyny (73-85%)
-amyloza nie pęcznieje rozpuszczając się w gorącej wodzie, a z jądrem barwi się na granatowo
-amylopektyna pęcznieje w wodzie i po ogrzaniu tworzy kleik skrobiowy, z jodem zabarwia się na purpurowo-brunatny
- są 3 typy enzymatycznego rozkładu skrobi: fosforoliza, hydroliza, transglikoliza
Mikroorg rozkładające skrobię:
-grzyby: Aspergillus oryzae, Aspergillus Niger, Aspergillus wenti
-bakterie: bacillus macerans, bacillus polymyxa, Bacillussubtilis, Clostridium thermohydrosulfuricum, Clostridium thermosulfurogenes
ROZKŁAD TŁUSZCZY:
- tłuszcze (lipidy) są estrami glicerolu i kw tłuszczowych
-hydrolizowane są przez drobnoustroje wytwarzające enzymy zwane lipazami
-enzymy te są wydzielane na zewn drobnoustr, gdzie katalizują rozkład tłuszczów do glicerolu i kw tłuszczowych. Glicerol metabolizowany jest następnie na drodze glikolizy, kw tłuszczowych, zaś rozkładane są w procesie B-oksydacji. Produkty obu szlaków wiązane są do cyklu Krebsa.
Drobnoustroje rozkładające tłuszcze: Staphylococcus ureus, Bacillus sp., Clostridium sp., Pseudomonas sp., Geotrichum sp.
AMONIFIKACJA - proces przekształcania zw org azotu i amoniaku
-może być procesem tlenowym i beztlenowym. Działają przy tym b różne enzymy uczestniczące w procesach dysymilacji
-w zależności od rodzaju enzymów i sposoby ich działania w warunkach tlenowych, oprócz amoniaku powstają jako produkty rozkładu ketokwasy, oksokwasy lub lotne kw tłuszczowe
- w warunkach beztlenowych pod wpływem dekarboksylaz produktami wyjściowymi mogą być aminy, CO2 i inne.
W glebie zależnie od warunków ekologicznych, amonifikacja może przebiegać z różnym nasileniem. Możemy tu wyróżnić:
-amonifikację brutto - taka ilość azotu amonowego, którą się otrzymuje z procesów min subst org
-amonifikacja netto - ilość amoniaku powstającego przy rozkładzie zw org z uwzględnieniem równoszceśnie zachodzących strat (nitryfikacja, utlenianie się, asymilacja)
RODZAJE AMONIFIKACJI:
-dezaminacja hydrolityczna
-dezaminacja reduktywna (polega na przekształceniu aminokwasu do kw nasyconego
CH3 - CH - COOH CH3 - CH2 - COOH
-dezaminacja desaturatywna - rozkład aminokwasu z wytworzeniem kw org nienasyconego
CH3 - CH - COOH CH2 - CH - COOH
-dezaminacja oksydatywna
CH3 - CH - COOH CH3 - CO - COOH
Dezaminacja tupu Sticklanda
CH3 - CH - COOH + CH3 - CH - COOH CH3COCOOH + CH3COOH
HYDROLIZA MOCZNIKA jest uważana z przykład deaminacji hydrolitycznej. Wiele bakterii ma zdolność wykorzystania mocznika jako źródła azotu, a hydroliza tego zw jest katalizowana przez ureazę:
H2N - CO - NH2 +H2O H2N - CO - NH2
Mocznik karbaminian
H2N - CO - NH4 +H2O (NH4)2 CO3
węglan amonu
(NH4)2 CO3 2 NH3 + CO2 + H2O
BAKTERIE MOCZNIKOWE: Urobacterium, Urobacillus, Bacillus pasteurii, Proteusz vulgaris, Sporosarcina ureae
AMONIFIKATORY: Clostridium sporogenes, C perfringens, C tetani, C botulinum
- względne beztlenowce: Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Proteusz vulgaris
- tlenowce: Bacillus subtilis, Bacillus cereus var Mycoides, Bacillus megaterium, Pseudomonas fluarescens, P aeruginosa, Serratia marcescens, Halobacterium salinarium.
STABILIZACJA AZOTU ORG może zachodzić w następujący sposób:
-stabilizowanie skł białkowych poprzez reakcja z innymi org skł takimi jak: lignina, tanina, chinony
-tworzenie biol odpornych kompleksów azotowych w wyniku reakcji form min azotu z ligniną lub subst próchniczymi
-adsorbcja skł azotowych przez min ilaste
-formowanie kompleksu między org formami azotu a wielowartościowymi kationami (np. Fe3+), które są stabilne
IMMOBILIZACJA - proces włączania azotu min w biomasę mikroorg, a nast w zw próchnicowe. Procesowi temu ulega 20-30% azotu zastosowanego w nawozach min. Z tej ilości ok. 70% przechodzi w zw próchnicowe. Szczególnie silnie immobilizowane jest azot w glebach o szer stosunku C:N (nawożenie słomą). Najkorzystniej jest gdy stosunek C:N w glebie wnosi 12-15:1.
STOSUNEK C:N, A WŁAŚCIWOŚCI MIKROBIOL GLEBY.
-jeśli stosunek C:N w rozkładanej subst org w glebie jest szerszy niż 25:1, następuje immobilizacja azotu - mikroorg pobierają azot przyswajalny dla roślin (uwstecznienie, białczanie)
-gdy stosunek C:N w rozkładanej subst org w glebie jest zbyt szeroki (powyżej 32:1) następuje spowolnienie mineralizacji i immobilizacji azotu.
-jeśli stosunek C:N w rozkładanej subst org w glebie jest większe niż 25:1 immobilizacja azotu nie zachodzi. Następuje intensywna mineralizacja azotu, który nie jest wykorzystywany przez rośliny
-w glebach stosunek C:N jest różny w zależności od rodzaju gleby
-dla większości gleb stosunek C:N jest w poziomie próchniczym wynosi od8-15 (najczęściej 10-12)
-w glebach darniowych stosunek C:N jest większy niż w glebach leśnych
-w poziomach próchniczych profilu glebowego stosunek C:N jest zwykle szerszy niż w poziomach min
-wraz ze wzrostem głębokości w profilu stosunek C:N z reguły zwęża się.
CHARAKTERYSTYKA AZOTOBACTER SP
- kom wielkości 3-6 um
-wielkość kom zależy nie tylko od gat bakterii, ale też od warunków wzrostu np. w glebie kom są małe, w hodowlach laboratoryjnych na bogatych pożywkach są znacznie większe.
-w obecności węglowodanów, zwłaszcza cukrów prostych. Azotobakter sp wytwarza otoczki i duże ilości śluzu. W obecności benzoesanu produkuje ciemny barwnik , zbliżony do melanin.
-kom Azotobakter sp izolowane z ryzosfery różnych roślin różnią się wyglądem.
- do rodz Azotobakter zalicza się gat reprezentatywne przez formy przystosowane bardziej do życia w wodzie lub w glebie. W glebie najczęściej spotyka się A chrococcum, natomiast gat A vinelandii występuje czasem w glebie, ale częściej żyje w glebie
-A sp jako bezwzględny tlenowiec jest b wrażliwy na natlenienie środowiska
-graniczna wartość pH dla tej bakterii w hodowli laboratoryjnej wynosi 5-8, ale optimum jego wzrostu i rozwoju nie przekracza 7,0-7,5.
-A sp jest b wymagający w stosunku do przyswajalnych form fosforu
-w obecności zw azotowych bakteria ta traci zdolność wiązania azotu z powietrza, może jedynie korzystać z azotanów, azotu amonowego i aminokwasów, nie ma jednak enzymów proteolitycznych,
W WARUNKACH BEZTLENOWYCH NAJBARDZIEJ WIĄŻE AZOT CLOSTRIDIUM PASTEURIANUM:
- jest to bakteria beztlenowa wytwarzająca przetrwalniki, może żyć jako mikroareofil w warunkach ograniczonego dostępu tlenu.
- występuje ona powszechnie w naszych glebach , jej liczebność w 1g gleby może wynosić 100 tys kom.
-mogą korzystać z różnych źródeł węgla
-od Azotobakter sp różnią się tym że nie przyswajają kw org, natomiast mogą asymilować pentozy, które są b słabo przyswajalne do Azotobakter sp
-Clostridium sp wymaga dodania do pożywki wyciągu z drożdży oraz peptonu.
- bakterie te wykazują dużą tolerancję hna pH środow, zakres pH 4,5-8,5
-bakterie fotosyntetyczne - są to zielone lub purpurowe bakterie siarkowe. Rosną na świetle w warunkach beztlenowych i w tych warunkach wiążą azot.
-wiązanie azotu przebiega przy udziale układu enzymatycznego zw kompleksem nitrogenazy, który składa się z nitrogenazy i reduktazy nitrogenazowej.
-do wiązania azotu są potrzebne 2 pierwsze molibden i nikiel. Molibden jest niezbędny do wiązania azotu i redukcji azotanu. Nikiel jest składnikiem hydrogenaz.
-organizmy wolnożyjące dostarczają od 1 do 3 kgN/ha/rok
-globalne wiązanie azotu 1,22x108 ton z czego 70% trafia do gleb uprawnych
-wiązanie azotu przez wolnożyjące sinice na polach ryżowych 30-50 kg N/ha/rok
-na 1 mol wiązanego N2 bakterie potrzebują 16 moli ATP
SINICE (Cyanobacteria)
-bezjądrowe, samożywne,
-jedno, wielokom i kolonie
-ściana kom G-
-zespół kom sinicowych otoczonych śluzem noszą nazwę cenobii
-bytują w wodach słodkich, morskich, salankach, na powierzchni wilgotnych gleb, na korze gleb, w przestrzeniach międzykom glonów
-sinice liczą ok. 2000 gat
-materiał zapasowy: kwas poli-beta-hydroksymasłowy, glikogen, lipidy, cyjanoficyna
-wiązanie wolnego azotu z powietrza zachodzi w heterotrofach
PRZEDSTAWICIELE SINIC
1.Gleocapsa minor - jednokom i kolonijna sinica żyjąca na wilgotnych podłożach i płytkich zbiornikach, gdzie tworzy śluzowate, kłaczkowate agregaty sinawej lub niebiesko-zielonej barwy. Kom są jajowate, kuliste lub pałeczkowate. Rozmnaża się przez podział kom.
2.Oscillatoria sp - ciało spłaszczone, wydłużone z szeregowo ułożonych kom dyskowatych. Rozmnażają się przez hormogonia. Przednia część ciała wykonuje wahadłowe ruchy.
Tylny koniec ciała jest wygięty. Drgalnica wytwarza osłonki śluzowe. Ma barwę niebiesko-ziel, żyje w wodach słodkich.
3.Nostoc sp (trzęsidło) - sinica nitkowata ze śluzowatymi otoczkami (pochewki), żyje w wodach słodkich i na wilgotnych podłożach. Tworzy heterocysty i śluzowe rozdzielacze fragmentujące nitkowate ciało na odcinki potomne (hormogonia)
FORMY WYST SIARKI W GLEBIE
-siarka w zw min: siarczany (Ca, Mg, K, Na), siarczki (siarczek żelaza FeS), piryt (FeS2), chalkopiryt (CuFeS)
-siarka w zw org: aminokwasy (cysteina, metionina, cystyna), kofaktory (biotyn, tiamina, koenzym A), kw limonowe, estry siarczanowe
-zawartość siarki w glebach waha się od 0,001 do 1,8, a nawet do 4%. Zazwyczaj nie przekracza 0,2%.
-Bakterie siarkowe - bakterie zróżnicowane pod względem morfologicznym i fizjologicznym, których cechą wspólną jest zdobywanie en przez zdobywanie min połączeń siarki. Są to org litotroficzne, wyst gł w wodach i w bagnach. Niektóre mogą występować w glebie.
PODZIAŁ BAKTERII SIARKOWYCH:
-bezbarwne nitkowate, -bezbarwne nienitkowate -barwne nienitkowate.
BEZBARWNE NITKOWATE (siarkowodorowe)
-występują w wodach i bagnach
-rodzaj Beggiatoa, Thiotrix
wśród rodzaju Beggiatoa wyróżnia się gat: Beggiatoa alba o gr nitek 2,5-5um, Beggiatoa arachnoidea - 5-15um, Beggiatoa gigantea - 25-55um, Beggiatoaminima - 1um
-rodz Beggiatoa tworzy dł wielokom nici wolnopływające w środowisku wodnym. Mogą one także przemieszczać się po stałych przedmiotach ruchem pełzającym.
-rodz Thiotrix prowadzi życie osiadłe
- bakterie te utleniają siarkowodór do siarki, którą odkładają w swoich kom w postaci półpłynnych kropli
-aby pobrać 1 drobinkę węgla z CO2 muszą utlenić 8-19 drobin siarki tak więc stosunek S:C wynosi 8-19:1
BEZBARWNE NIENITKOWATE (Bakt tlenowe)
-wyst w błotach i glebie
-pałeczki
-utleniają wolną siarkę, siarkowodór i tiosiarczany
-są to gat:
-Thiobacillus denieryficans (powoduje straty azotu do atmosfery)
-T. thiooxidans (optymalne pH 2-5, bezwzględnie tlenowy, ruchliwy)
-T. thioparus (rośnie najlepiej w temp 25-30C, opt pH 5-8
BARWNE NITKOWATE
-ze wzgl na zaw w kom barwników, dzielimy je na:
-purpurowe (Chromatium okeni, Thiocapsa roseopersicina, Lampracystis roseporsicina
-zielona (Clathrochloris, Pelodictyon agregatum, Chlorobium limicola)
BAKTERIE REDUKUJĄCE MIN ZW SIARKI
-Pesulfovibrio desulfuricans
-redukcja siarczanów odbywa się w warunkach beztlenowych w glebach zalewowych
-pH powyżej 5,5
-źródłem węgla dla tej bakterii są różne węglowodany, alkohole i kw org