Mikroskop fluorescencyjny (Reichert – 1911)
Źródła światła:
Lampa rtęciowa (emisja 240-800 nm)
Lampa kseonowa (420-470 nm)
Lampa halogenowa (495 nm)

Jasność fluorescencji: J= C(NA²/P²)

Barwniki fluorescencyjne:
-Oranż akrydyny (wzbudzenie 400-500 nm, emisja 530-590 nm)
-Izotiocyjanian
-
-
-

W mikroskopie fluorescencyjnym światło pada na preparat przez obiektyw, ulega wzbudzeniu, a potem znowu wpada przez obiektyw.

Mikroskop konfokalny (Marvin Ninski, ’60 XX w.) – używany jest do obrazowania preperatów oznaczonych barwnikami fluorescencyjnymi. Pracuje na bazie m. f., ale zamiast żarówki UV lub Xe, źródłem świata są lasery. Im lepszy mikroskop, tym więcej laserów o określonej długości fali.
Światło emisji zawsze jest dłuższe od wzbudzającego. Jest transmitowane do komputera, gdzie ulega przetworzeniu w obraz. Światło jest ogniskowane punktowo, nie ma więc zjawiska nieostrości.
Światło z lasera pada na lustro półprzepuszczalne, zostaje odbite w obiektyw, gdzie oświetla preparat. Wzbudzone światło zostaje skierowane z powrotem na obiektyw, przechodzi przez półprzepuszczalne lustro, zostaje przepuszczone przez przesłonę punktową i rzucone na detektor.
Możemy skanować wgłąb preparatu, etapami, punktowo, tworząc obraz 3D badanego obiektu.
Celem przyspieszenia skanowania stosowana jest tzw. Przesłona wirująca – porowata powierzchnia, która umożliwia skanowanie w wielu punktach jednocześnie.
Tło jest ciemne, co umożliwia dokładniejsze widzenie preparatu.

Mikroskop polaryzacyjny – przeznaczony do oglądania preparatów dwułomnych – zdolnych do rozszczepiania światła. W takim mikroskopie preparat oświetla źródło światła spolaryzowanego. Rozszczepiona wiązka kierowana jest do analizatora, który mierzy zmiany amplitudy. Umożliwia nam to oglądanie strukur z dużą dokładnością.
Kontrast faz staje się bardziej wyraźny w mikroskopie, gdy zastosuje się pryzmat (kondensor) Nomarskiego – interferencyjno-różniczkowy. Wiązka światła jest rozszczepiana na dwie –jedna przechodzi przez preparat, druga przez jego medium. Potem obiektyw Wollastona (kolejny pryzmat Nomarskiego, powodujący interferencję) i analizator sprawdzający zmiany amplitudy.
Powstaje złudzenie trójwymiaru, co zwiększa widoczność szczegółów preparatu.

Odkryto gen kodujący białko zielonej fluorescencji oraz sposób na wprowadzenie go do genomu badanego zwierzęcia. Podczepiamy „zielony” gen pod promotor i gotowe, wybrane białko emituje światło.
Celem oznaczenia danej tkanki należy „naznaczyć” czynnikiem kodującym zielone białko transkrypcyjne specyficzne białko występujące wyłącznie w danej tkance.

Mikroskop elektronowy działa na zasadzie emisji wiązki elektronów.
Transmisyjny – elektrony przechodzą przez preparat.
Scanningowy – elektronu odbijają się od preparatu.
Budowa ME:
1. Katoda z osłoną Wehnelta;
2. Anoda;
3. Soczewki elektromagnetyczne;
4. Przesłony.
Układ prózniowy:
1. Pompa rotacyjna.
2. Pompa dyfuzyjna.
Napięcie przyspieszające – 50-120kV
Napięcie 1000V – prędkość elektronów rzędu 18.730 km/s – dł. Fali 0,04 nm
Najnowsze mikroskopy elektronowe nie posiadają już aparatów fotograficznych – informacje wędrują bezpośrednio do komputera. Umożliwia to obróbkę, np. nałożenie kolorów na czarno-biały odczyt.
Zderzenie elektronów z preparatem powoduje emisję wiązek elektronów ugiętych elastycznie, nieelastycznie i nieugiętych. Są one odczytywane przez mikroskop i na ich podstawie tworzony jest preparat.

Przygotowanie materiału biologicznego do obserwacji przez mikroskop elektronowy:
1. Utrwalanie (fizyczne, chemiczne);
2. Utwarzanie (żywice akrylowe, polestrowe, epoksydowe);
3. Wykonywanie skrawków (ultramikrotomy z zastosowaniem noży szklanych lub diamentowych)
- szare 60nm;
- srebrne 90nm;
- złote 150nm.
Osadzanie skrawków na siatkach.
4. Kontrastowanie:
- Pozytywowe (sole ołowiu i uranu);
- Negatywowe (sole wolframu lub uranu);
Cieniowanie metalami ciężkimi.

Mikroskop sił atomowych (lata 80. XX w.) (AFM) – analizuje siły pomiędzy atomami na specjalnym ostrzu skanującym a atomami w preparacie. Ostrze osadzone jest na dźwigni. Gdy zostaje przeciągnięte po preparacie, specjalny czujnik (czujnik ugięcia dźwigni) odbiera nacisk na ostrze. Jest ona (dźwignia) oświetlana promieniem lasera, który jest odbijany w kierunku czujnika. Czujnik odbiera wariacje toru promienia i kieruje informacje do detektora, gdzie są one przetwarzane.
AFM służy, na przykład, do analizy żywych komórek (nawet w roztworze wodnym!), struktury substancji polimerowych, a nawet chromosomów!

Inne metody stosowane w badaniach biologii komórki:

1. Uzyskiwanie frakcji komórkowych – sedymentacja szybkościowa i równowagowa – wirowanie z olbrzymią prędkością;

2. Hodowla komórek in vitro;

3. Sekwencjonowanie DNA – umożliwia poznawanie sekwencji DNA, a nawet całych genomów;

4. Modyfikacje genetyczne (np. wstawienie muszce-owocówce białka zielonej fluorescencji w układ nerwowy, wyłączanie niektórych genów…);

5. Chromatografia – uzyskiwanie homogenatu i rozdzielanie go na różne substancje (głównie białka, ale inne też);

6. Elektroforeza – ponownie rozdzielanie substancji dzięki ich naładowaniu;

7. Krystalografia rentgenowska (oświetlanie białka promieniami rentgenowskimi, co umożliwia poznanie jego struktury);

8. Spektroskopia masowa (ekstrakt z komórek - homogenat – badanie jego zawartości. W polu magnetycznym następuje ich odchylenie i na podstawie jego wartości możemy określić skład homogenatu);

9. Spektroskopia jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR). – pod wpływem pola magnetycznego jądra atomów emitują energię, na podstawie wartości której możemy poznać ich skład.