Deaminacja oksydacyjna adeniny prowadzi do powstania hipoksantyny, która tworzy pary z cytozyną. W następnym cyklu replikacji dochodzi do zamiany pary A-T na G-C. Do uszkodzeń oksydacyjnych dochodzi na skutek obecności w komórkach tlenowych reaktywnych związków tlenu (ponadtlenku i nadtlenku wodoru, rodnika hydroksylowego). Zmodyfikowane oksydacyjnie zasady mogą powodować błędy w replikacji oraz powstawanie wiązań poprzecznych białko-DNA.
Alkilacja – wprowadzenie grup alkilowych (np. metylowych) do różnych pozycji kwasów nukleinowych. Czynniki alkilujące: metylosulfonian metylu, etylonitrozomocznik. Alkilowane zasady: 7-metyloguanina, 3-metyloguanina, O6-metyloguanina.
Niektóre z alkilowanych zasad przeszkadzają w rozplataniu dwuniciowego DNA podczas replikacji lub transkrypcji. Metylacja guaniny do O6-metyloguaniny jest bezpośrednio mutagenna, ponieważ tworzy podczas replikacji parę z tyminą: G→C O6met-G → T.
Ochrony przed mutagennymi czynnikami alkilującymi dostarcza alkilotransferaza, usuwająca grupy alkilowe z bezpośrednio mutagennej
O6-metyloguaniny. Obrona przed letalnymi mutacjami wymaga indukcji glikozylazy DNA, która usuwa alkilowane zasady za pomocą naprawy przez wycinanie zasad.
Dimery pirymidynowe mogą ulegać ponownej monomeryzacji pod wpływem fotoliaz (enzymów fotoreaktywujących) w obecności światła widzialnego.
Rekombinacja DNA
Genomy są strukturami dynamicznymi, które ewoluują w czasie na skutek skumulowanych efektów zmian sekwencji, zachodzących na małą skalę, wywołanych przez mutacje oraz wielkoskalowych rearanżacji spowodowanych przez rekombinację.
Rekombinacja powoduje przebudowanie struktury części genomu, np. przez wymianę fragmentów chromosomów homologicznych podczas mejozy lub przez transpozycję ruchomego elementu z jednej pozycji w inną, znajdującą się na tym samym lub innym chromosomie. Rekombinacja jest przeprowadzana i kontrolowana przez enzymy i inne białka.
Rodzaje rekombinacji:
rekombinacja homologiczna,
rekombinacja umiejscowiona,
transpozycja.
Cechy rekombinacji homologicznej:
dwie dwuniciowe cząsteczki DNA zawierające regiony homologiczne ustawiają się równolegle i zachodzi proces crossing-over,
miejsce wymiany łańcuchów może znajdować się gdziekolwiek w obrębie homologicznego regionu cząsteczek DNA uczestniczących w rekombinacji,
w miejscu wymiany fragmentów DNA sekwencja nukleotydów najczęściej nie ulega zmianie.
Model rekombinacji homologicznej Hollidaya
W wyniku wymiany fragmentów polinukleotydów, tworzy się heterodupleks. Następnie przerwy są sklejane przez ligazę DNA i powstaje struktura Hollidaya.
Przemieszczanie się rozgałęzienia jest katalizowane przez białka RuvA i RuvB, przyłączające się do struktury Hollidaya. Cztery kopie RuvA wiążą się bezpośrednio z rozgałęzieniem tworząc rdzeń, do którego z każdej strony przyłączają się dwa pierścienie RuvB, każdy utworzony przez 8 cząsteczek białka. Tak powstała struktura obraca helisy tak, by uzyskać ruch rozgałęzienia. Następnie kompleks RuvAB odłącza się i jest zastępowany dwoma białkami RuvC, które dokonują cięcia rozłączającego strukturę Hollidaya.
Inicjacja rekombinacji przez nacięcie tylko jednej nici – modyfikacja Meselsona-Raddinga (1975)
Jednoniciowe pęknięcie pojawia się tylko w jednej podwójnej helisie, a wytworzony wolny koniec wypiera jedną z nici, tworząc pętlę D. Potem następuje przecięcie wypchniętej nici w miejscu połączenia obszaru jedno- i dwuniciowego i powstaje heterodupleks.
Szlak RecBCD w rekombinacji homologicznej u E. coli
Rekombinacja jest inicjowana przez enzym RecBCD, który wykazuje aktywność nukleazy i helikazy. Enzym wiąże się z jednym końcem cząsteczki liniowej i rozwija ją, dopóki nie napotyka pierwszej kopii ośmionukleotydowej sekwencji 5’-GCTGGTGG-3’ (miejsce χ; u E. coli występuje co ok. 6kb). Następnie dokonuje jednoniciowego nacięcia i kontynuuje rozwijanie helisy DNA. Powstały wolny koniec dokonuje inwazji drugiej, nienaruszonej helisy DNA.
Białko RecA należy do białek wiążących jednoniciowy DNA; tworzy opłaszczony przez białka fi lament DNA zdolny do inwazji nienaruszonej podwójnej helisy i utworzenia pętli D.
Rekombinacja umiejscowiona
Dotyczy wymiany niehomologicznych lub częściowo homologicznych fragmentów DNA, dokonywanej za pośrednictwem białek rozpoznających określone sekwencje DNA.
Integracja genomu bakteriofaga λ do genomu E. coli
Integracja zachodzi poprzez rekombinację między miejscami att, jednym w genomie faga λ, a drugim w chromosomie E. coli, mającymi w centralnym regionie identyczną sekwencję 15 nukleotydów. Rekombinacja zachodzi między dwiema cząsteczkami kolistymi i powstaje jedna większa.
Transpozycja
Transpozycja jest procesem, który z wykorzystaniem rekombinacji prowadzi do przeniesienia fragmentu DNA z jednego miejsca w genomie na inne. Przenoszony fragment (transpozon) jest otoczony przez parę krótkich powtórzeń prostych (odwrócone powtórzenie końcowe; inverted terminal repeats, ITR), które tworzą się podczas procesu transpozycji. W procesie transpozycji uczestniczy nukleaza transpozaza.
Sekwencje insercyjne (IS, insertion sequences, długość ok. 1kbp) – najprostsze transpozony.
Transpozony E. coli składają się z genu transpozazy oskrzydlonego przez krótkie powtórzenia końcowe o przeciwnej orientacji (IR – inverted repeats, ok. 20 nukleotydów).
Sekwencje insercyjne mogą oskrzydlać gen bakteryjny – transpozon złożony.
Transpozaza przecina końce transpozonu i DNA E. coli. Zwisające końce docelowego miejsca DNA łączą się z transpozonem, a powstające luki są wypełnione przez polimerazę DNA. W efekcie sekwencja o długości 4-12bp, znajdująca się w akceptorowym DNA zostaje skopiowana, a sekwencja ulegająca transpozycji umieszczona pomiędzy powtórzeniami.
Rodzaje transpozonów ze względu na sposób przenoszenia się:
przenoszące się replikatywnie – oryginalny transpozon pozostaje na miejscu, a jego nowa kopia pojawia się w innym miejscu w genomie,
przenoszące się konserwatywnie – oryginalny transpozon przemieszcza się na nowe miejsce w procesie wycięcia i wklejenia,
retroelementy – przenoszą się za pośrednictwem kopii RNA.
Donorowe i docelowe odcinki DNA mogą być fragmentami tej samej cząsteczki DNA (np. genomu bakteryjnego) lub znajdować się w różnych cząsteczkach DNA (np. w chromosomie bakteryjnym i w plazmidzie).
Sekwencja wprowadzana do genu podczas transpozycji najczęściej powoduje jego inaktywację. Niektóre transpozony zawierają promotory transkrypcyjne, które umiejscawiając się w pobliżu jakichś genów mogą wpływać na poziom ich ekspresji lub na zmianę warunków kontrolowania genu przez komórkę. Rekombinacja między sekwencjami inercyjnymi może być przyczyną powstania delecji, inwersji lub duplikacji genów.