Wstęp do metody hodowli in vitro

Hodowle zwierzęce in vitro:

• Wzrost 20 – 50 godzin

• Wysoka wrażliwość

• Media skomplikowane, złożone pożywki

• Temperatura 29 – 37^oC

• pH 7,0 – 7,4

Komórki:

• Organizm wielokomórkowy > 100 trylionów komórek

• Kręgowce – więcej niż 100 typów komórek

• Różnią się:

• Wielkością

• Kształtem

• Budową

• Funkcją

Hodowla komórek in vitro jest to metoda utrzymywania komórek prokariotycznych, eukariotycznych, zwierzęcych lub roślinnych przy życiu poza organizmem w ściśle kontrolowanych warunkach.

Hodowla in vitro narządów, tkanek i komórek odbywa się w określonej temperaturze w inkubatorze, w medium zawierającym czynniki wzrostowe i składniki odżywiające komórkę.

Hodowla in vitro:

• Trwa dłużej niż 24 h (gdy trwa krócej to mówimy o inkubacji, nie hodowli!)

• W trakcie hodowli komórek powstają klony, w których wszystkie komórki mają taki sam genotyp (chyba, ze podczas hodowli zachodzą mutacje)

Inoculum – wyjściowa zawiesina komórkowa wprowadzana do medium w celu założenia hodowli

Typy hodowli in vitro:

• Hodowla tkanek (tissue culture) – hodowla wszystkich elementów pochodzących z tkanki (eksplantaty)

• Hodowla narządów (organ culture) – hodowle całych narządów

• Hodowla komórek (cell culture) – hodowla komórek zdyspersowanych

• Hodowla histotypowa (histotypic culture) – hodowla komórek na elementach macierzy pozakomórkowego reagregujących i odtwarzających strukturę tkanki

• Hodowla organotypowa (organotypic culture) – hodowla komórek na elementach macierzy reorganizujących się w narząd

Hodowla narządowa:

• Hodowla narządów, głównie pochodzących z embrionów

• Zachowuje sferyczną lub trójwymiarową strukturę

• Zalety:

• Utrzymuje prawidłowe funkcje fizjologiczne

• Komórki pozostają terminalnie zróżnicowane

• Wady:

• Ograniczenie rozmiaru (tylko małe)

• Wolny wzrost

• Dla każdego eksperymentu jest konieczne ponowne uzyskanie komórek ze świeżego eksplantu

Hodowla tkankowa:

• Hodowla fragmentu tkanki pobranego z organizmu – eksplantu

• Po umieszczeniu w naczyniu przyczepia się i następuje migracja komórek

• Zalety:

• Część fizjologicznych funkcji zostaje zachowana

• Korzystniejszy stosunek wielkości niż w przypadku hodowli narządu

• Wady:

• Stopniowo dochodzi do utraty oryginalnej organizacji tkanki

Hodowla komórkowa:

• Hodowla uzyskana z komórek migrujących z eksplantu lub z umieszczonych jako inoculum, uprzednio wyizolowanych pojedynczych komórek

• Komórki mogą rosnąć w zawiesinie (np. komórki krwi) lub jako monolayer (przyczepione do ścianki naczynia)

• Zalety:

• Uzyskanie kolejnych generacji komórek (linie komórkowe)

• Może być stosowana na szeroką skalę

• Wady:

• Cechy komórek ulegają zmianom w porównaniu z warunkami in vivo

Laboratorium, sterylizacja, pożywki, naczynia do hodowli

Pracownia in vitro:

Powodzenie techniki hodowli komórek:

• Zagrożeniem dla hodowli komórek są mikroorganizmy

• Przed zakażeniami zabezpieczają:

• Antybiotyki

• Aseptyczne warunki laboratoryjne

• Czysta powierzchnia do pracy

• Zachowanie czystości przez personel – mycie rąk, fartuch, nakrycie głowy, rękawiczki, maska

• Sterylność naczyń i przedmiotów używanych do hodowli)

Rodzaje zakażeń w hodowli in vitro:

• Bakterie

• Drożdże

• Grzyby

• Wirusy

• Mykoplazma – rodzaj bakterii kryptycznej i trwałej, zwykle nie niszczy komórki

Wszystkie materiały wchodzące w kontakt z hodowlami komórkowymi muszą być sterylne:

• Jednorazowe pipety, butelki, płytki

• Szkło – jałowione przez autoklawowanie lub 2 h w 180^oC

• Surowica, antybiotyki, dodatki (witaminy, sole) – sterylizowane poprzez filtrowanie (średnica porów 0,22 µm)

• Praca w warunkach jałowych, pod komorą, często kontrole jałowości (posiewy) zarówno komory jak i inkubatora

• Kontrola w kierunku zanieczyszczeń mykoplazmami

Sterylność vs aseptyczność:

• Sterylność – pozbawienie wszelkich żywych form (bakterie, grzyby, wirusy)

• Aseptyczność – redukcja ilości żywych mikroorganizmów

• Większość rzeczy używanych do pracy musi być sterylna:

• Promienie UV, gamma

• Wysoka temperatura (sterylizacja sucha)

• Autoklaw – wysoka temperatura i ciśnienie pary

• Filtrowanie (średnica porów 0,22 µm)

Komora laminarna – miejsce pracy:

• Powietrze filtrowane – filtry HEPA wykonane ze szkła spiekanego

• Filtracja powietrza odbywa się przez pory wielkości 0,3mikrom

• Zatrzymują większość (co najmniej 99,97%) zanieczyszczeń mechanicznych, a także komórki grzybów, pierwotniaków, bakterii oraz część wirusów

• Mają zamontowane również lampy UV

Typy komory laminarnej:

• Nadmuch powietrza poziomy (powietrze nie krąży – wydostaje si z komory)

• Nadmuch powietrza pionowy (komory typu biohazard – zamknięty obieg powietrza)

• Komora horyzontalna – powietrze płynie w kierunku pracującego – nie może być stosowana do pracy z materiałem niebezpiecznym – chroni tylko materiał znajdujący się w jej wnętrzu

• Komora wertykalna – powietrze jest filtrowane zanim wydostanie się z komory – kierunek przepływu powietrza chroni zarówno materiał jak i pracującego

Efektywność komory laminarnej:

• Efektywność komory laminarnej zależy od ciśnienia z jakim powietrze przechodzi przez filtr

• Kiedy oporność filtrów wzrasta, wzrasta ciśnienie i spada szybkość przepływu przez filtry

• Przepływ poniżej 0,4 m/s powoduje spadek sterylności komory laminarnej

• Rutynowo należy kontrolować wydajność filtrów HEPA (co 3 – 6 miesięcy)

Poziom ryzyka – zależy od materiału, z którym się pracuje:

• Niskie ryzyko

• Materiał z przebadanego źródła (np. zwierzęta laboratoryjne)

• Ustalone linie komórkowe nie pochodzące od człowieka/naczelnych

• Dobrze scharakteryzowane ludzkie linie diploidalne określonym czasie życia

• Średnie ryzyko

• Słabo scharakteryzowane linie komórek ssaków

• Wysokie ryzyko

• Linie komórkowe pochodzące z tkanek lub krwi ludzkiej

• Linie komórkowe z endogennymi patogenami (np. wirusami)

• Linie komórkowe używane jako model eksperymentalnych infekcji (modele komórkowe chorób zakaźnych)

Klasy bezpieczeństwa komór laminarnych:

• Klasa I – prosta komora laminarna, powietrze może wydostawać się na zewnątrz

• Klasa II – na zewnątrz wydostaje się przefiltrowane powietrze

• Klasa III – służą do pracy z materiałem wysokiego ryzyka

Sterylizacja pożywek i płynów – filtry membranowe o średnicy porów 0,22 µm:

• Małej objętości - filtry na strzykawkach

• Dużej objętości – filtry z pompką wodną

Antybiotyki:

• Redukują zakażenia

• Pomagają w rozwoju odporności hodowli na zakażenia

• Mogą tłumić i ukrywać zakażenia

• Mogą mieć wpływ na wzrost i metabolizm komórek

• Niski indeks terapeutyczny (wysoce toksyczne):

• Amfoterycyna B (grzyby, drożdże)

• Chloramfenikol

• Tetracykliny

• Nystatyna (grzyby)

• Wysoki indeks terapeutyczny (mało toksyczne):

• Penicylina

• Streptomycyna

• Gentamycyna

• Kanamycyna

• Neomycyna

Warunki hodowli:

• Temperatura

• O₂, CO₂

• pH

• Wilgotność powietrza

Inkubator CO₂ – komórki zwierzęce hoduje się w temperaturze 37^oC w wilgotnej atmosferze przy 5% CO₂

Naczynia do hodowli komórek in vitro:

• Komórki na błonie posiadają ujemne ładunki

• Plastik zazwyczaj jest odpowiednio przygotowany aby ułatwiać komórkom przyczepianie – ma ładunki dodatnie

• Można dodać czynniki ułatwiające przyczepianie, np. kolagen, fibronektynę, lamininę, polilizynę, poliornitynę

• Butelki:

• Zakręcane

• Chronią przed rozlaniem

• Trudna manipulacja wewnątrz

• Zakrętki mogą być lite lub z filtrem

• Płytki wielodołkowe:

• Umożliwiają przeprowadzanie serii powtórzeń i kombinacji doświadczalnych

• 6, 12, 24, 48, 96 dołków

• Szalki Petriego:

• Łatwa manipulacja wewnątrz

• Duża powierzchnia – duża powierzchnia parowania

• Łatwe do rozlania i zakażenia przy manipulacji

• Naczynia do hodowli komórek w zawiesinie:

• Zaopatrzone w mieszadło (mechaniczne, magnetyczne)

Pożywka/medium hodowlane:

• Znaczenie pożywki:

• Jest źródłem energii

• Dostarcza substancji budulcowych (aminokwasy, kwasy tłuszczowe, mikroelementy, sole, witaminy itp.)

• Utrzymuje odpowiednie pH i osmolarność hodowli

• Pożywka pokrywa komórki na tyle cienką warstwą aby możliwa była penetracja gazów – naczyń hodowlanych nie napełnia się w całości!

• Składniki pożywki:

• Zbalansowany roztwór soli: bufor fosforanowy, jony Mg²⁺, Ca²⁺

• Jony i mikroelementy – utrzymujące odpowiednie ciśnienie osmotyczne

• Źródła energii – glukoza, glutamina

• Aminokwasy – służą jako prekursory do syntezy białek

• Glukoza jest głównym węglowodanem dostarczającym energii (czasem może być zastępowana fruktozą)

• Witaminy, sole, mikroelementy – wykorzystywane jako kofaktory w reakcjach biochemicznych

• Barwniki – czerwień fenolowa – wskaźnik pH – optymalne pH dla komórek wynosi 7,4 – 7,8

• Dwuwęglan sodu

• Tworzy układ buforowy, który działa podobnie do systemu buforowego krwi in vivo:

CO₂ + H₂O ↔ HCO₃^- + H⁺

• Zawartość około 24mM współdziała z 5% CO2 w utrzymaniu właściwego pH pożywki

• Dwuwęglan sodu – pomaga utrzymać wzrost komórek przy wysokich stężeniach CO₂

• Antybiotyki: penicylina/streptomycyna (Pen/Strep)

• Pirogronian sodu – produkt rozkładu glukozy w cyklu Krebsa, pomaga generować więcej energii (ATP)

Przykłady najczęściej stosowanych pożywek:

• Minimum essential media (MEM)

• Dulbeccos modifief eagle media (DMEM)

• RPMI – 1630 – do hodowli komórek rosnących w zawiesinie

• RPMI – 1640 – do hodowli komórek większości ssaków

Surowica:

• Najprostszy naturalny i najczęściej stosowany suplement pożywki

• Medium niezdefiniowane – zawiera surowicę

• Medium zdefiniowane – nie zawiera surowicy

• Stosuje się dodatek 0 – 20%

• Rola surowicy:

• Czynniki wzrostowe

• Hormony

• Transferryna Fe

• Lipidy

• Insulina

• Czynniki hamujące działanie enzymów proteolityczncyh

• Minimalizuje tarcie i „shear stress”

• Czynniki adhezyjne ułatwiające przyczepianie komórek

• Rodzaje surowicy:

• Płodowa surowica bydlęca ang. fetal bovine serum (FBS) lub fetal calf serum (FCS) – z krwi płodów bydlęcych

• Surowica końska, ang. horse serum (HS)

• Surowica cielęca, ang. bovine calf serum lub newborn calf serum (NCS, CS, BCS)

• Ograniczenia używania surowicy:

• Źródło zakażeń mykoplazmami, wirusami

• Może zwierać toksyny

• Serie surowic nigdy nie są identyczne

• Obecność swoistych przeciwciał

• Inaktywacja surowicy:

• Historycznie – 30 min w temperaturze 56^oC – zniszczenie dopełniacza ale i wielu czynników wzrostowych, witamin, aminokwasów)

• Stężenie składników dopełniacza w surowicy płodowej stanowi 1 – 3% stężenia osobnika dorosłego

• Nawet ogrzanie do temperatury 37^oC niszczy dopełniacz

• Wybielacz:

• Używany do niszczenia pozostałych w naczyniach i probówkach po zakończeniu hodowli komórek

• Po 5 minutach w wybielaczu można wylać pozostałości do zlewu i wyrzucić naczynia

Rząd wielkości:

• Pojedyncza komórka > 0,01 mm

• Kolonia komórek 1 mm

• Naczynie z koloniami komórek 100 mm

Mikroskop odwrócony:

• Oświetlenie np. typu kontrast – faz (umożliwia obserwację niewybarwionych preparatów)

• Obiekt znajduje się nad obiektywem – nie stosuje się barwienia, bo wiązało by się to z utrwaleniem i zabijaniem komórek, lecz częściej zależy nam na oglądaniu komórek w czasie wzrostu w czasie rzeczywistym

• Można oglądać komórki rosnące na szalce

• Widzimy komórki od dołu (rosnące na dnie)

W mikroskopie świetlnym komórki muszą być barwione.

Morfologia komórek w hodowli in vitro, klasyfikacja hodowli in vitro

Morfologia komórek w hodowli in vitro:

• Zawiesina – pojedyncze komórki lub agregaty swobodnie pływające w pożywce

• Monolayer – warstwa komórek przyczepionych do dna naczynia

• Zachowanie komórek w hodowli zależy od pochodzenia komórek

• Kształt komórek przyczepionych do podłoża ma również związek z ich pochodzeniem

• Endotelialne

• Fibroblasty

• Egzotelialne

• Nerwowe

• Mioblasty

Komórki zależne i niezależne od przyczepienia:

• Komórki pochodzące z prawidłowych tkanek (nienowotworowych) określa się mianem „zależne od przyczepienia” – musza przyczepić się do podłoża aby przetrwać (wyjątkiem są komórki krwi)

• Komórki rosnące w zawiesinie są niezależne od przyczepienia – zwykle są to komórki nowotworowe

Charakterystyka komórek prawidłowych:

• Wykazują zahamowanie kontaktowe wzrostu – kiedy zapełni całą dostępną powierzchnię przestają się dzielić

• Rosną tylko wtedy gdy jest pomiędzy nimi miejsce

Charakterystyka komórek transformowanych (nowotworowe):

• Nie wykazują kontaktowanego zahamowania wzrostu – rosną nawet gdy zapełniły całą powierzchnię

• Mogą rosnąć warstwowo jedne na drugich

Hodowle konfluentne – 100% gęstości – komórki nie mogą się dzielić, bo nie ma miejsca

Konfulencja – gęstość komórek w hodowli in vitro:

• Aby komórki w hodowli in vitro miały prawidłowy cykl komórkowy i namnażały się musza być pasażowane

• Jeśli komórki pokrywaj całą dostępną powierzchnie tempo wzrostu spada, komórki starzeją się i umierają

• Pasażowanie zapobiega również przetrwaniu w hodowli komórek, które uległy selekcji cech i mutacjom (tworzenie subklonów)

• Zbyt mała ilość komórek w hodowli jest równie niekorzystna jak zbyt duża ilość

Klasyfikacja hodowli in vitro ze względu na rodzaj hodowanego materiału:

• Hodowle narządów:

• Utrzymywanie sferycznego lub trójwymiarowego kształtu

• Utrzymanie specyficznych interakcji histologicznych

• Hodowle eksplantów:

• Fragmenty tkanek

• Po przyczepieniu następuje migracja komórek na powierzchnię naczynia

• Hodowle komórkowe – hodowla rozdzielonych komórek:

• Przyczepione komórki jako monolayer

• Zawiesina komórek w pożywce

Klasyfikacja hodowli komórek in vitro ze względu na pochodzenie komórek i czas trwania:

• Hodowle pierwotne (pierwszorzędowe)

• Linie komórkowe:

• Pierwotne linie komórkowe

• Ustalone linie komórkowe

• Transformowane linie komórkowe (unieśmiertelnione)

Hodowle pierwotne i linie komórkowe, cykl komórek w hodowli in vitro

Hodowle pierwotne:

• Pochodzą bezpośrednio z tkanki lub narządu i są hodowane jako:

• Komórki migrujące w hodowli eksplantów

• Komórki wyizolowane przez dyspersję i wprowadzone do hodowli jako zawiesina (inoculum)

• Zalety:

• Zachowują wiele cech komórek zróżnicowanych podobnie jak in vivo, ale mogą zmieniać się w warunkach in vitro

Schemat powstawania hodowli pierwotnej:

Narząd → fragmenty tkanki lub narządu → umieszczenie eksplantu w hodowli

↓

Eksplanty

↓ ↓

Izolacja enzymatyczna ––––––––––––––––––––→ monolayer lub zawiesina

• Wady hodowli pierwotnej:

• Często wymagają uśmiercenia zwierzęcia

• Procedura zakładania hodowli pierwotnej jest zwykle czasochłonna i żmudna

• Mogą być utrzymywane w hodowli tylko przez określony i zwykle krótki czas

• Muszą być zakładane dla każdego eksperymentu

• Stanowią heterogenną populację komórek

• Ponieważ zwykle są heterogenne, stopniowo dochodzi do przerostu wszędobylskimi fibroblastami

Hodowle narządów lub eksplantów:

Schemat powstawania hodowli narządów lub eksplantów:

Narząd → kawałki tkanki lub cały narząd → izolacja/pocięcie tkanki lub narządu → hodowla w medium

↓

cały narząd lub tkanka

Charakterystyka hodowli pierwotnej eksplantów:

• Fragment tkanki zanurzony w odpowiednio napowietrzonej tkanki

• Utrzymywana jest trójwymiarowa struktura (3D) oraz interakcje międzykomórkowe

• Ograniczenie stanowi rozmiar pozwalający na dyfuzję gazów i składników odżywczych (zwykle ok. 1 mm³)

• Ograniczona ilość eksperymentów

• Powolny i ograniczony jest rozrost tkanek

• Hodowla może być wykorzystywana do wyprowadzenia hodowli komórek

Izolacja → rozdrobnienie → eksplant → hodowla

Hodowle pierwotne uzyskane przez wysianie pojedynczych komórek:

Narząd/tkanka → rozdrobnienie mechaniczne i izolacja enzymatyczna komórek → odwirowanie komórek i zawieszenie w pożywce → wysianie inoculum → adhezja komórek → identyfikacja

Cykl komórkowy dzieli się na poszczególne fazy:

• G1 – synteza RNA, białek, wzrost komórki

• S – replikacja DNA

• G2 – przygotowanie do podziału

• M – podział komórki

(G0 – „wyjście” komórki z cyklu komórkowego)

1. Faza lag – rozpoczyna się po pasażu i wysianiu komórek, jest to okres adaptacji komórek (do 3 dni):

• W przypadku hodowli komórek rosnących w zawiesinie nie ma tej fazy!

• Komórki odbudowują elementy glikokaliksu zniszczone przez trypsynę

• Przyczepiają się do podłoża i rozpłaszczają

• Nie dzielą się, a liczba ich może się nawet zmniejszać, bo część komórek zniszczonych nie przyczepia się

• Wzrasta ilość enzymów, głównie polimeraz DNA

• Komórki wchodzą w fazę G1

1. Faza log – faza logarytmicznego wzrostu (dni: 3 – 8)

• Jest to okres największego wzrostu liczby komórek, komórki dzielą się intensywnie (w czasie mitozy odrywają się od podłoża, a po podziale ponownie się przyczepiają)

• Faza ta kończy się jednym lub dwoma podwojeniami populacji komórek i osiągnięciem konfluencji

• Komórki cechuje wysoka żywotność i wysokie tempo metabolizmu

• Długość fazy log zależy od gęstości wyjściowej hodowli

• Komórki przechodzą poszczególne fazy cyklu komórkowego

1. Faza plateau – faza stacjonarna (dni: 8 – 13)

• Komórki osiągają konfluencję i przestają się dzielić – cała dostępna powierzchnia naczynia jest zajęta

• W przypadku komórek prawidłowych, w tych warunkach dochodzi do zahamowania migracji i kontaktowego zahamowania wzrostu

• Początkowo ilość komórek się już nie zmienia, a potem część komórek zaczyna umierać, sporadycznie obserwuje się jeszcze podziały komórkowe

Hodowla konfluentna – komórki zajmują całą dostępną powierzchnię naczynia hodowlanego:

• Taka hodowla najszybciej wykorzystuje medium

• Komórki trzeba już koniecznie pasażować, bo dłuższe przetrzymanie komórek w konfluencji może doprowadzić albo do transformacji, albo do wyjścia komórek z cyklu – wejście w fazę G0

• Komórek w fazie G0 nie da się już pasażować, a taka hodowla obumiera!

• Najlepiej pasażować komórki przy tzw. semikonfluencji, kiedy ciągle są one w fazie log wzrostu (najlepsza kondycja komórek)

Ocena konfluencji:

• Wygląd powierzchni naczynia pokrytej przez rosnące komórki oceniana „na oko”

• Optymalna konfluencja dla przenoszenia (pasażu) komórek do nowego naczynia to 70 – 80%

• Zbyt mała – komórki będą długo w fazie lag i nie będą proliferować

• Zbyt wysoka – komórki mogą się odróżnicowywać, wejść w fazę G0 i nie będzie można ich odkleić od podłoża

Linie komórkowe

Hodowla pierwotna – hodowla uzyskana z pojedynczych komórek ewentualnie z eksplantów tkanek lub narządów pobranych bezpośrednio z organizmu

Linia komórkowa – populacja komórek, która powstaje z hodowli pierwotnej po pierwszym pasażu

Pasażowanie – przeniesienie komórek z jednego naczynia hodowlanego do innego

Numer pasażu mówi ile razy komórki były pasażowane, a więc odnosi się do wieku komórek

Podwojenie populacji lub czas podwojenia populacji – czas, w którym podwaja się liczba komórek,

np. od 1 x 106 do 2 x 106

Linie komórkowe w nazwach mają zakodowane następujące informacje:

• Pochodzenie komórek, np. NHB = Normal Human Brain

• Numer linii, jeżeli kilka linii było wyprowadzanych, np. NHB – 2

• Numer pasażu lub liczbę podwojeń populacji i stosunek rozdziału komórek: NHB 2/2 lub NHB 2/4

Wyprowadzanie linii komórkowych:

• Izolacja enzymatyczna komórek → przeszczepienie i rozpłaszczenie komórek (kilka godzin) → hodowla pierwotna → proliferacja komórek → pierwszy pasaż – początek linii komórkowej → selekcja i identyfikacja komórek

• Izolacja ekspantów z tkanek lub narządów → adhezja tkanki do podłoża i migracja komórek (1 tydzień) → hodowla pierwotna → proliferacja komórek → pierwszy pasaż – początek linii komórkowej → selekcja i identyfikacja komórek

Starzenie komórek – limit Hayflick’a:

• Limit Hayflick’a – maksymalna liczba podziałów komórkowych

• Liczba podziałów jest zależna od rodzaju komórki i organizmu, z którego pochodzi

• Dla komórek ludzkich liczba podziałów przeciętnie wynosi około 50x

• Limit Hayflick’a dotyczy tylko komórek zróżnicowanych

Life – span – czas życia komórek w hodowli in vitro (ale też w żywym organizmie):

• Starzenie się komórek w hodowli in vitro jest odzwierciedleniem starzenia się populacji komórkowych in vivo

• Czas życia komórek linii w hodowli zależy od wieku organizmu, z którego pobrano komórki, cyklu narządu i rodzaju tkanki

• Linie komórkowe uzyskane z normalnych, diploidalnych komórek i tkanek mogą być hodowane tylko przez określony czas

• Posiadają więc limitowaną ilość pokoleń, a więc też określoną liczbę pasaży

• Dłużej żyją linie komórkowe wprowadzone z komórek zarodków, natomiast znacznie krócej pochodzące od osobnika dorosłego

Rodzaje linii komórkowych:

• Pierwotne linie komórkowe, o określonym czasie życia czyli life – span (ang. finite cell lines)

• Linie ciągłe (ang. contineous cell lines)

• Linie transformowane

• Linie nowotworowe

Pierwotne linie komórkowe czyli linie komórkowe o określonym czasie życia:

• Komórki pochodzą bezpośrednio z organizmu

• Mają limitowany czas życia i wzrostu w hodowli – zwykle komórki zamierają po około 50 podziałach

• β – galaktozydaza – marker starzenia komórek

Transformacją komórek nazywamy zmianę fenotypu wynikającego ze zmiany materiału genetycznego

Rodzaje transformacji:

• Spontaniczna (in vitro), np. w hodowli konfluentnej)

• Transfekcja – wywołana celowo

• Wywołana karcinogenami chemicznymi (tkanka nowotworowa)

Linie komórkowe transformowane nazywa się liniami unieśmiertelnionymi lub transformowanymi

Linie komórkowe o określonym czasie życia:

• Posiadają life – span

• Komórki prawidłowe

• Nietransformowane

• Muszą przyczepić się do podłoża (monolayer)

• Podlegają kontaktowemu zahamowaniu wzrostu i migracji

• Gęstość limituje wzrost

• Wymagają dużych stężeń surowicy w medium

• Czas podwojenia populacji 24 – 96 h

• Wiek = ilość podwojeń populacji

• Wzrost zależny od obecności czynników wzrostowych w medium

Linie komórkowe ciągłe:

• Są nieśmiertelne

• Komórki macierzyste, komórki nowotworowe, komórki transformowane

• Mogą rosnąć w zawiesinie

• Brak zahamowania kontaktowego wzrostu

• Wzrost limituje dostępność składników w medium

• Często nie wymagają obecności surowicy lub tylko małych jej ilości

• Czas podwojenia populacji: 12 – 24 h

• Wiek komórek = numer pasażu

• Wzrost niezależny od obecności czynników wzrostowych w medium

Homogenność linii komórkowych:

• Po 1 lub 2 pasażach linie komórkowe przybierają stan homogenności

• Początkowo mieszane populacje komórek przy każdym przenoszeniu i ze względu na warunki hodowli ulegają naturalnej selekcji

• W hodowli pozostają komórki, które najlepiej przystosowały się do danych warunków

Hybrydomy – komórki powstające w wyniku fuzji dwóch typów komórek, np.

Mouse cell + rat cell → hybrid rat-mouse cell → hybrid rat – mouse cell lines maintained in petri dish

Obserwacja komórek w hodowli:

• Ocena koloru pożywki:

• Prawidłowy kolor – lekko pomarańczowy

• Zbyt żółty – zbyt duże zagęszczenie komórek lub zakażenie bakteryjne

• Różowe – zbyt niskie stężenie CO₂, komórki martwe

• Obserwacja komórek w mikroskopie odwróconym:

• Stopień rozpłaszczenia komórek, morfologia

• Konfluencja hodowli

• Ilość komórek proliferujących

Zmiany morfologiczne w komórkach świadczące o złej kondycji hodowli:

• Pojawienie się ziarnistości

• Wakuolizacja cytoplazmy

• Okrągły kształt i odrywanie się od podłoża

→ należy wtedy zmienić medium, a jeżeli hodowla jest już konfluentna, należy komórki przepasażować

Postępowanie z hodowlami komórkowymi:

• Jeśli konfluencja wynosi 70 – 80% – pasażowanie komórek

• Jeśli konfluencja jest niska

• Prowadzić hodowlę dalej przez max 4 dni zmieniając regularnie medium

• Po tym czasie, jeśli nic się nie zmienia spróbować przepasażować komórki

Wymiana pożywki:

• Częstotliwość zmian pożywki zależy od gęstości komórek, tempa proliferacji oraz tempa metabolizmu komórek

• Linie szybko proliferujące, szybciej wykorzystują medium, dlatego trzeba częściej zmieniać im pożywkę

• Kiedy braknie składników w medium, komórki przestają się dzielić, a potem zmienia się ich morfologia

• Komórki transformowane linii ciągłych szybko proliferują, są też wrażliwsze na niedobory składników odżywczych oraz zmiany pH

Dezaktywacja zużytego medium hodowlanego oraz naczyń hodowlanych:

• Dodać wybielacza chlorowego w ilości, która spowoduje przezroczystość medium i zmianę koloru

• Poczekać 5 minut

• Wylać zawartość do zlewu

• Wyrzucić naczynia do śmieci

Pasażowanie komórek rosnących w zawiesinie:

• Łatwiejsze do pomiaru – nie ma kolejności odklejania komórek

• Również w zawiesinie mogą osiągać konfluencję

• Zmiana medium polega na wymianie co najmniej 1/3 objętości pożywki

• Czasem komórki są przyczepione słabo lub wcale się nie przyczepiają do podłoża, wystarczy nimi energicznie wstrząsnąć

• Pasaż = rozcieńczenie

Procedura pasażowania komórek przyczepionych do podłoża:

1. Usunięcie pożywki

2. 3x płukanie komórek PBS bez jonów Ca i Mg

3. Dodanie trypsyny + EDTA

4. Obserwacja procesu odczepiania się komórek (pod mikroskopem odwróconym)

5. Inaktywacja trypsyny – surowicą lub medium z surowicą

6. Mieszanie zawiesiny komórek pipetą

7. Liczenie komórek w komorze

8. Zawieszanie komórek w medium i rozdział pomiędzy odpowiednią ilość naczyń hodowlanych

Trypsyna z EDTA:

• Enzym używany do odklejania komórek od dna naczynia hodowlanego

• Odszczepia połączenia białkowe (LIZ lub ARG) matrix pozakomórkowego

• EDTA jest chelatorem jonów wapnia, które znajdują się w medium

• Temperatura 37^oC zwiększa aktywność trypsyny

• Traci aktywność pozostawiona w cieple, np. w łaźni wodnej, 20 minut

• Zbyt długie działanie obniża zawartość komórek

Problemy z trypsyną – trypsyna może nie działać jeśli:

• Jest zbyt zimna

• Straciła aktywność np. na skutek złego przechowywania, zbyt długiego ogrzewania

• W naczyniu hodowlanym jest pozostałość surowicy

Komórki nie odklejają się, jeśli:

• Rosły w naczyniu zbyt długo (> 4 dni) i uległy odróżnicowaniu

• Hodowla jest konfluentna – trypsyna nie jest w stanie dotrzeć do dna naczynia – można spróbować potrząsnąć naczyniem

Zamrażanie komórek:

• Umożliwia przechowywanie linii komórkowych w ciekłym azocie nawet do kilkudziesięciu lat

• Komórki przed zamrożeniem zawiesza się w medium z czynnikiem krioprotekcyjnym

• Do zamrażania komórek używa się wyłącznie probówek do tego przeznaczonych – wykonanych ze specjalnego plastiku!

• Proces zamrażania musi odbywać się wolno (aby nie powstały kryształy)

• Przeciętna szybkość zamrażania komórek – około 1^oC na minutę

Przykłady medium do zamrażania komórek:

• 10% DMSO + 90% płodowej surowicy cielęcej

• 10% DMSO + 90% medium z odpowiednim stężeniem surowicy (jak w medium do hodowli)

• 10% glicerolu + 90% surowicy

Zazwyczaj ilość krioprotektanta to ok. 7,5%

Efektywność mrożenia komórek – to liczba (%) komórek, które przyczepiają się po rozmrożeniu

Procedura mrożenia i przechowywanie linii komórkowych:

• Odklejenie komórek od podłoża

• Odwirowanie i usunięciu supernatantu

• Zawieszenie komórek w medium do mrożenia – bankowanie

• Umieszczenie w pudełku z izopropanolem w – 70^oC na 24 h

• Przeniesienie komórek do ciekłego azotu – 196^oC

Rozmrażanie komórek:

• Trzeba to robić szybko, najlepiej na łaźni wodnej w temperaturze 37^oC i szybko przenieść do czystej pożywki

• DMSO (dimetylosulfotlenek) w temperaturze pokojowej jest toksyczny dla komórek!

Istnieją dwie szkoły: odwirowywanie komórek i rozpuszczenie peletek w nowym medium lub rozcieńczenie medium z DMSO w dużej ilości nowego medium.

Transport komórek:

• Linie zamrożone przewozi się na suchym lodzie

• Można transportować również linie rosnące czyli w butelkach napełnionych do pełna pożywką

Banki linii komórkowych:

• Europejska Kolekcja Hodowli Komórkowych- powstała w 1984 roku w Wielkiej Brytanii, ang. ECACC

• Amerykańska Kolekcja Hodowli Komórkowych – ATCC

• dysponuje ponad 5 000 linii komórkowych ludzkich i zwierzęcych

• Są to linie komórkowe wyprowadzone z prawidłowych tkanek ludzkich, jak też z komórek nowotworowych

• Linie komórkowe przed wpisaniem ich do kolekcji, przechodzą długie procedury identyfikacji, kontrolę jakościową

• Teksty na obecność mykoplazm, bakterii, wirusów, drożdży, grzybów

• Wszystkie linie są sprzedawane z kompletnym opisem i dokładnymi praktycznymi wytycznymi dotyczącymi hodowli

Inne źródła – otrzymywanie linii komórkowych od innych naukowców z innych laboratoriów, nie zawsze mają one jednak pewne pochodzenie i istnieje duże ryzyko błędnej identyfikacji oraz zakażeń.

Wyprowadzenie linii komórkowych z próbek od pacjentów – nowe linie komórkowe mogą być wyprowadzane z tkanek i nowotworowych, pobieranych bezpośrednio od pacjentów albo poprzez pobieranie w postacie iniekcji komórek nowotworowych.

Hodowle pierwotne czy linie komórkowe?

Hodowle pierwotne:

• Komórki bliższe stadium in vivo

• Bardziej zależne od czynników wzrostowych i matrix pozakomórkowego

• Lepsze do badania interakcji komórkowych

Linie komórkowe:

• Łatwa dostępność dużej ilości materiału

• Lepiej zdefiniowane i scharakteryzowane

• Szybko proliferują

• Mniejsza różnica między eksperymentami

• Nie ma potrzeby zabijania zwierzęcia

Metody izolacji, liczenia i identyfikacji komórek

Izolacja komórek – polega na oddzieleniu komórek od macierzy międzykomórkowej i uzyskaniu zawiesiny pojedynczych komórek

Metody izolacji i rozdzielania komórek:

• Mechaniczna (skrobanie, przecieranie przez sitka)

• Enzymatyczna – trawienie enzymami proteolitycznymi (kolagenaza, trypsyna)

• Wirowanie w gradiencie (np. surowicy, perkolu, fikolu)

• Sortery (np. cytofluorymetr przepływowy)

Izolacja mechaniczna + enzymatyczna komórek z tkanek z dużą ilością włókien kolagenowych:

Tkanka → rozdrobnienie mechaniczne i trawienie kolagenazą → wypłukanie kolagenazy → trawienie trypsyną → inaktywacja trypsyny i odwirowanie komórek → zawieszenie komórek i rozlanie do studzienek

Rozdział komórek przez wirowanie:

• W gradiencie prędkości – frakcje wędrują w zależności od ciężaru – im mniejsza frakcja tym większej prędkości trzeba użyć

• W gradiencie gęstości – frakcje wędrują w zależności od rozmiaru i kształtu, gdy użyje się niskiego gradientu cukru (5 – 20%); w zależności od gęstości frakcji, gdy użyje się wysokiego gradientu cukru (20 – 70%)

Liczenie komórek

• Hemacytometry np. komora Bürkera

• Automatyczne liczniki komórek

Określenie żywotności komórek

Stosowane barwniki:

• Błękit trypanu – komórki martwe – niebieskie jądra

• Bromek etydyny – komórki martwe – jądra czerwone

• Jodek propydyny – komórki martwe – jądra czerwone

• Dwuoctan fluoresceiny – komórki żywe – zielona fluorescencja cytoplazmy

Obliczanie ilości komórek/ml

Całkowita liczba policzonych komórek x rozcieńczenie x 10,000

liczba kwadratów

Np. Jeśli policzyliśmy np. 62 komórki, rozcieńczenie wynosiło 1 : 1, a ilość policzonych kwadratów np. 10 to:

62/10 x 2 x 10⁴ = 1.24x10⁵ czyli 124 000 komórek na 1 ml

Oznaczenie żywotności komórek

Ilość komórek żywych x 100%

Całkowita ilość komórek

Np. 54/62 x 100 = 87.09%

Hodowle typu monolyer i hodowle w zawiesinie

Zawiesina:

• Komórki rosną pływając w pożywce

• Mogą proliferować w zawiesinie (niezależnie od przyczepienia)

Monolayer (metoda 1 warstwy):

• Komórki przyczepione do podłoża migrują/proliferują

• Są zależne od przyczepienia

• Sposób wzrostu charakterystyczny dla większości komórek

Adhezja komórek:

• Odbywa się dzięki obecnym na ich powierzchni receptorom dla cząsteczek matrix pozakomórkowego

• Rozpłaszczenie komórek zaczyna się w momencie, kiedy wydzielą one specjalne białka i proteoglikany, tworzące matrix np. fibronektynę, lamininę, kolagen

• Substancje te wiążą się z podłożem, a dopiero do nich wiążą komórki

• W wiązaniu komórek z podłożem biorą udział jony wapnia i magnezu oraz białka pochodzące z surowicy dodawanej do medium

Proces przyczepiania komórek do podłoża:

Adsorpcja → kontakt → przywiązanie (1 – 2 h) → rozsiewanie (24 h)

Identyfikacja komórek

Komórki identyfikuje się biorąc pod uwagę:

• Kariotyp

• Antygeny powierzchniowe – immunohistochemiczne

• Elementy cytoszkieletu – immunohistochemia, immunofluorescencja

• Markery – PCR, western blot

Hodowle imitujące warunki fizjologiczne:

• Ko – kultury

• Hodowle utrzymywane na warstwie odżywczej

• Hodowle komórek 3D podtrzymywane na odpowiednich matrycach

• Hodowle 3D uniemożliwiające adhezję komórek

Zalety i wady hodowli komórek rosnących w systemie dwuwymiarowym (2D)

• Zalety:

• Łatwe w stosowaniu przez relatywnie długi czas

• Wystandaryzowane protokoły hodowli

• Wady:

• Nie są reprezentatywne dla warunków in vivo

Hodowle trójwymiarowe 3D:

• Komórki rosną na lub wewnątrz składników błony podstawnej lub macierzy pozakomórkowej albo na szkieletach z biomateriałów

• Hodowle w warunkach niskiej grawitacji (np. wytrząsarki) tworzą agregaty i sferoidy

Hodowle w zawiesinie i hodowle trójwymiarowe:

• Zalety:

• Bardziej reprezentatywne dla warunków in vivo

• Pewne procesy są aktywowane tylko w komórkach hodowlanych 3D

• Wady:

• Brak wystandaryzowanych protokołów

Bioreaktory:

• Do hodowli dużej ilości komórek

• Uzyskiwanie produktu

• W inżynierii tkankowej do hodowli specyficznego typu tkanki lub narządu ex vivo

Hodowle na mikronośnikach (microcarriers):

• Hodowane komórki przyczepiają się do kulek dekstranowych, żelatynowych lub szklanych

• Mikronośniki zapewniają dużą powierzchnię przy małej objętości pożywki

• Agregaty:

• Złożone z jednego lub kilku typów komórek

• Optymalna średnica 250 – 500 μm

• Hoduje się je w naczyniach podawanych wolnej rotacji

• Sferoidy:

• Powstają z agregatów

• Średnia 600 – 800 μm

• W centrum tworzy się martwica

Hodowla na agarze w kolagenie

Hodowle histotypowe lub organotypowe:

• Wysoka gęstość, układy trójwymiarowe – próbują odtworzyć strukturę przestrzenna tkanki lub narządu

• Histotypowe – jeden rodzaj komórek rosnący trójwymiarowo

• Organotypowe:

• Więcej niż jeden typ komórek

• Budowa 3D tkanki/narządu, która powstaje na kawałku tkanki/narządu

• Zachowuje funkcje fizjologiczne jak in vivo

• Morfogeneza taka sama jak in vivo

• Ograniczenie – rozmiary hodowanej tkanki

Metoda siatkowa – Grid Method (Trowell, 1959) – na granicy faz

• Metalowe siateczki z zagiętymi brzegami

• Jeden z 2 wymiarów eksplantów < 1 mm

• Hodowla 48 h

Hodowle eksplantów

• Hodowle małych frakcji tkanek/narządów umieszczonych w naczyniu z medium

• Eksplanty w hodowli umieszcza się bezpośrednio po pobraniu

• Możliwy niewielki wzrost i 1 lub 2 podziały komórkowe, potem starzenie i śmierć

• Dobry model bliski in vivo

• Krótka hodowla (do 2 – 3 dni), gdy dłużej – migracja komórek i można zakładać hodowle pierwotne

Ko – kultury (współhodowle) – 2 typy komórek:

• Hodowlane

• Pomocnicze – stymulują wzrost komórek właściwych

Ko – kultury w insertach – hodowla dwóch typów komórek oddzielonych porowatą membraną

Hodowle pierwotne komórek nerwowych

Rodzaje hodowli komórek nerwowych:

• Linie komórkowe (klonalne, nieśmiertelne)

• Gliomy

• Neuroblastomy

• Transferowane linie komórek nerwowych

• Hodowle pierwotne

• Astrocyty

• Oligodendrocyty

• Komórki Schwanna

• Mikroglej

• Neurony

• Hodowle komórek w insertach

Typy komórek nerwowych:

• Monolayer

• Mieszane agregaty

• Skrawki mózgu

• Eksplanty

Rodzaje komórek nerwowych w hodowli in vitro:

• Neurony

• Komórki glejowe

• Makroglej (astrocyty i oligodendrocyty)

• Mikroglej (komórki immunologiczne układu nerwowego)

Cechy komórek nerwowych warunkujące ich hodowle in vitro:

• Neurony

• Nie mogą się dzielić

• Mogą się różnicować

• Są bardzo wrażliwe na różnego typu uszkodzenia np. niedotlenienie stres oksydacyjny

• Komórki glejowe:

• Zachowują zdolność podziałów

• Zajmują miejsce zniszczonych neuronów (tzw. glejoza)

• Stanowią rodzaj buforu/wygaszacza nadmiernie zaktywowanych neuronów

• Tkanka nerwowa z której izoluje się komórki zawiera zarówno neurony jak i komórki glejowe

• Udział procentowy poszczególnych typów komórek zmienia się z wiekiem

• Po 16 dniu życia płodowego ilość astrocytów w korze mózgowej gwałtownie wzrasta

• Zwykle również w hodowli neuronów wzrasta zanieczyszczenie komórkami glejowymi

Markery komórek nerwowych:

• Neurony – MAP2 (microtubule associated protein – białko wiążące mikrotubule)

• Komórki glejowe

• Astrocyty – GFAP – glejowe kwaśne białko włókienkowe

• Oligodendrocyty – galactose cerobiose – glikolipid powierzchniowy

Izolacja i hodowla pierwotna neuronów kory mózgowej szczura:

• Materiał: tkanka z 15 – 16 dniowych płodów

• Tkankę rozdrabnia się mechanicznie i enzymatycznie poprzez ciecie a następnie pipetowanie

• Następnie tkankę poddaje się delikatnej trypsynizacji (0,05% roztwór trypsyny, 15 minut w temperaturze pokojowej) co pozwala na uzyskanie dużej liczby zdrowych komórek

• Komórki wysiewa się na szlaki pokryte polilizyną , poliornityną, kolagenem lub polilizyną z lamininą

• Hodowle prowadzi się w pożywce z FBS i/lub suplementem:

• Selen

• Putrescyna

• Transferryna

• Progesteron

• BSA

• Insulina

• Antybiotyk

Warunki izolacji i hodowli neuronów:

• Bardzo ważny jest krótki czas pobierania i izolowania struktur np. z 8 – 12 płodów, 30 – 45 minut uwagi na niedotlenienie tkanki

• Konieczne jest dokładne usunięcie naczyń krwionośnych, aby uniknąć zanieczyszczenie fibroblastami

• Należy unikać napowietrzenia zawiesiny komórek podczas mieszania komórek (stres oksydacyjny)

• Należy unikać zbyt długiego przetrzymywania hodowli poza inkubatorem ( w ciągu 1 godziny z pożywki znika prawie cały CO₂)

pH pożywki:

• pH 7,2 – 7,2 utrzymuje się dzięki równowadze pomiędzy 5 – 6% stężeniem CO₂ w inkubatorze a buforami znajdującymi się w pożywce (węglan sodu, białka surowicy)

• Komórki które się dzielą – intensywnie oddychają a więc produkują dużo CO₂ i w ten sposób regulują pH pożywki

• Neurony które się nie dzielą oddychają słabiej – trzeba wiec nasilić ich oddychanie podając np. pirogronianu sodu oraz zastosować pożywkę z buforami niezależnymi od dwutlenku węgla np. HEPES, Ham’s Nutrien Mixture F12

Glukoza:

• Jest obecna w pożywce jako czynnik energetyczny, a wiec nasilający oddychanie komórkowe

• Nadmiar glukozy może wywołać skutki niepożądane jak np. spadek aktywności dysmutazy nadtlenkowej potrzebnej w walce z wolnymi rodnikami, czy też wzrost os molarności pożywki powyżej dopuszczonego poziomu

Glutamina:

• Jest źródłem energii komórek w hodowli in vitro wykorzystywana do syntezy nukleotydów purynowych

• Jednak gdy w pożywce nadmiernie wzrośnie ilość produktów rozpadu glutaminy, tj. kwasu pirolidono – 5 karboksylowego praz amoniaku może być szkodliwa dla neuronów

• W celu ograniczenia hydrolizy glutaminy, zimną pożywkę należy doprowadzić najpierw do temperatury pokojowej a dopiero później do 37^oC

• Można także zastąpić glutaminą jej dwupeptydem , który jest stabilny i nie ulega w tych warunkach hydrolizie.

Skład suplementu stosowanego do pożywek neuronalnych:

• Selen jest kofaktorem w syntezie glutationu (antyutleniacz), chroni komórki przed fotouszkodzeniem

• Stężenie glutationu można również zwiększyć podaniem cysteiny

• Transferryna jest białkiem transportującym Fe

• Putrescyna jest prekursorem poliamid

• Insulina i BSA działają troficznie (odżywczo)

• Ekspozycja hodowli na światło np. w czasie oglądania jej pod mikroskopem, indukuje procesy fotooksydacyjne (w pożywce powstają reaktywne cząstki tlenu i wolne rodniki → stres oksydacyjny)

• Aby mu przeciwdziałać do pożywki dodaje się np. selen, który działa jako zmiatacz wolnych rodników

• Użycie witaminy E chroni komórki przed peroksydacją wielonienasyconych kwasów tłuszczowych

• Stosowanie pożywki bez surowicy ogranicza stężenie glutaminianu, co osłabia jej aktywność monoaminooksydazy praz nasila wychwyt cysteiny przez neurony i w konsekwencji zwiększa ich szansę przeżycia w hodowli

Antybiotyki:

• Najczęściej używa się penicyliny (25 – 100 U/ml) i streptomycyny (25 – 100 mg/ml) lub gentamycyny (10 – 100 mg/ml)

• Należy pamiętać że czerwień fenolowa działa jak agonista estrogenowy, a więc w niektórych badaniach lepiej używać pożywki nie zawierającej tego barwnika

Hodowla neuronów ziarnistych móżdżku:

• Materiał tkanka z 8 – dniowych osesków szczura

• Liczba uzyskiwanych komórek – ok. 20 mln/zwierzę

Hodowle neuronów Hipokampa:

• Hodowle neuronów piramidowych rogu Ammona wyprowadza się z 18 – dniowych płodów lub noworodków szczura

• Mimo ze im starsze zwierzę, tym większa proliferacja gleju, uzyskuje się dość dużą liczbę neuronów)

• Hodowle wzbogaconą w neurony ziarniste zakrętu zębatego wyprowadza się z 5 – dniowych osesków (jednak uzyskuje się bardzo małą liczbę komórek)

Hamowanie przerastania hodowli neuronów komórkami glejowymi:

• W celu zahamowania rozrostu gleju najczęściej się stosuje 5 – 1 mM AraC występującą też pod nazwą cytozar

• Ponieważ stężenie wyższe niż 1 mM AraC indukuje apoptozę w neuronach dlatego coraz częściej stosuje się mniej toksyczne cytostatyki np. B27, AraA

• Hodowla w pożywkach bez surowicy ogranicza proliferację astrocytów stymulowaną przez znajdujące się w surowicy miogeny i eliminuje konieczność stosowania cytostatyków

Komórki glejowe:

Komórki glejowe mogą mieć różne kształty:

• Wielokątny – astrocyty

• Komórki z rozgałęzionymi wypustkami rozmieszczonymi symetrycznie – mikroglej

• Komórki z jedną lub dwiema wypustkami

Izolacja i hodowla astrocytów:

• Materiał może pochodzić z różnych obszarów mózgu noworodka

• Komórki izoluje się podobnie jak neurony najpierw poprzez rozdrabnianie mechaniczne, a następnie enzymatycznie

• Otrzymaną zawiesinę komórek wysiewa się w pożywce np. DMEM/F12 z dodatkiem 10 – 20% FBS i 1% glutaminy i hoduje 7 – 9 dni zmieniając medium na świeże co 48 – 72 h

• Aby uzyskać czyste hodowle samych astrocytów po namnażaniu hodowlę poddaje się wstrząsaniu w temp. 35^oC przez 6 – 7 h, aby oddzielić mocnej przyczepione astrocyty typu 1 od neuronów, astrocytów typu 2 i oligodnedrocytów

• W wyniku wytrząsania giną zarówno neurony jak i oligodedrocyty (odrywają się od podłoża)

• Otrzymane w ten sposób dwa typy astrocytów można następnie hodować razem lub osobno

• Astrocyty można zarówno pasażować jak i mrozić

Hodowla zróżnicowanych neuronalnie komórek linii PC12:

• Linia wprowadzona z nowotworu nadnerczy szczura, z komórek chromofilnych

• Komórki te zanim ulegną zróżnicowaniu rosną klonalnie, dzielą się intensywnie podwajając populacją co 3 – 4 dni

• W obecności NFG lub bFGF różnicują się w nieproliferujące komórki nerwowe

• Do różnicowania wymagają podłoża pokrytego kolagenem lub Poli – lizyną

Przykład badań na komórkach nerwowych w hodowli in vitro:

• Neurony:

• Przeżywalność (liczenie komórek barwionych błękitem trypanu, pomiar aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH) i enzymów mitochondrialnych (test MTT)

• Wzrost wypustek nerwowych

• Różnicowanie

• Apoptoza fizjologiczna i eksperymentalna

• Pomiary elektrofizjologiczne

• Komórki glejowe:

• Synteza neurosteroidów

• Synteza cytokin (mikroglej wywodzi się z monocytów i makrofagów)

Apoptoza w układzie nerwowym:

• Apoptoza pojawia się na każdym etapie rozwoju układu nerwowego i dotyczy zarówno komórek mitotycznych jak i post –mitotycznych

• Około 40 – 80% komórek nerwowych ginie w wyniku spontanicznej apoptozy

• Około 50% w okresie embrionalnym

• Około 30% w okresie około – urodzeniowym

• Apoptoza w rozwoju układu nerwowego jest spowodowana niedoborem czynników troficznych – neurotroficzna teoria apoptozy

Apoptoza w chorobach neurodegeneracyjnych:

• Alzheimer

• Choroba Huntingtona

• Parkinson

• Epilepsja

Unieśmiertelnianie komórek

Metody transfekcji komórek

Transformowane linie komórkowe – pochodzą z tkanek nowotworów , przechodzą spontaniczną mutację (transformację), za pomocą transformacji chemicznej lub wirusów

Transformacja :

• Unieśmiertelnianie

• Utrata zahamowania kontaktowego wzrostu

• Uzyskanie zdolności do wzrostu niezależnie od przyczepienia

Transfekcja = transformacja + infekcja

Transfekcja vs. Transforamacja:

• Transformacja – aktywne wprowadzenie obcego materiału genetycznego do komórki - termin używany w przypadku komórek prokariotycznych

• Transfekcja – proces dostarczenia materiału genetycznego do komórki eukariotycznej, wprowadzenie transgenu (genu reporterowego lub terapeutycznego) oraz syntetycznych oligonukleotydów

Rodzaje transfekcji:

• Stabilna – charakteryzuje się integracją DNA do genomu

• Przejściowa – cząsteczka DNA, nie ulega integracji , ekspresja wprowadzonego genu zostaje zgubiona w miarę kolejnych podziałów komórkowych

Transformacja przejściowa:

• Wysoki poziom ekspresji wprowadzonego materiału w komórce

• Różny procent komórek wykazuje ekspresję transgenu

• Wymaga dużej ilości DNA

• DNA nie jest dziedziczone przez komórki potomne

• Szybko i łatwa do wykazania

Transformacja stabilna:

• Transgen jest na stałe zintegrowany z genomem

• Trangen losowo ulega integracji z genomem komórki

• Słabszy poziom ekspresji, -nie wszystkie komórki wykazują ekspresję

• Trudniejsza ko – ekspresja

• Wymagają selekcji klonów

Metody transfekcji:

• Fizyczne:

• Mikroiniekcja

• Elektroporacja

• Metody balistyczne tzw. strzelba genowa

• Chemiczne:

• DEAE – destran

• Fosforan wapnia

• Syntetyczne polimery nośniki DNA (kationowe)

• Liposomy – transfekcja liposomami to lipofekcja

• Wirusowe:

• Adenowirusowe,

• A, AV, retrowirusy i inne.

Elektroporacja – za pomocą krótkotrwałego szoku elektrycznego (wysokie napięcie), w roztworze zawierającym kwas nukleinowy

• Szok powoduje przejściowe powstanie porów, ważna jest amplituda i czas trwania impulsu elektrycznego

• Zależy od linearnej korelacji między ilością dna a obecnego dna w komórce

• Może być wykorzystywana do transfekcji stabilnej

Elektroporacja → zawieszenie w buforze do elektroporacji →dodanie DNA do zawiesiny komórkowej → elektroporacja → selekcja transfekowanych komórek

Mikroiniekcja – roztwór nagiego DNA jest wstrzykiwany bezpośrednio do jądra komórkowego lub dla RNA do cytoplazmy za pomocą specjalnie spreparowanej kapilary

Ko – precypitacja fosforanem wapnia:

• Tania i skuteczna metoda wykorzystywana do transfekcji przejściowej i stabilnej

• Polega na zmieszaniu DNA z CaCl₂ oraz kontrolowanym podawania do zbuforowanego roztworu soli fizjologiczne – fosforan dodaje się w celu wytrącenia precypitatu

• Precypitat jest pobierany przez komórki na drodze endocytozy lub fagocytozy

Metoda DEAE – Dextran:

• Kationowy polimer wiążący się z DNA, ułatwia wiązanie się z błoną komórkową i endocytozę

• Nadmiar ładunków dodatnich umożliwia związanie polimeru DNA/DEAE z ujemnie naładowaną błoną komórkową i endocytozę kompleksu

• Metoda jest skuteczna do krótkotrwałej transfekcji

Syntetyczne nośniki DNA:

• Grupa nie wirusowych nośników DNA – tworzą różne związki chemiczne i struktury ponadmolekularne (supermolekularne) obdarzone ładunkiem dodatnim

• Lipidy i liposomy kationowe – lipopleksy

• Kationowe polipeptydy oraz polimery i kopolimery kationowe – polipleksy

• Dendrymery

Liposomy kationowe:

• Sferyczne dwuwarstwowe struktury składające się z cząsteczek lipidów obdarzonych ładunkiem dodatnim i cząsteczki lipidu obojętnego elektrycznie – np. DOTMA lub DOPE

• Oddziaływania jonowe między liposomami i DNA umożliwiają formowanie kompleksów i fuzję z błoną

• Ułatwiają uwolnienie DNA z endosomów

• Liposomy są również wykorzystywane jako nośniki leków i składników kosmetyków

• Liposomy dają wysoką skuteczność transfekcji różnymi cząstkami, oligonukleotydami, DNA i RNA o różnej wielkości stosownie do metody

• Technika daje efekty długotrwałe – transfekcja stabilna

Kationowe polipeptydy i białka :

• Poli – L – lizyna PLL

• Poli – L – ornityna

• Białka takie jak protamina, albumina

• Syntetyczne poliaminoestry

Dendromery – to wysokocząsteczkowe polimery o dobrze zdefiniowanej architekturze , wyróżniające się jednorodnym rozkładem ładunku(polimery poliamidoaminowe PAMAM)

Zalety nie wirusowych nośników DNA:

• Brak ograniczenia wielkości transgenu

• Brak integracji nośników z genomem

• Małe ryzyko rekombinacji genetycznej

• Możliwość transfekowania wielu typów komórek

• Nie powodują odczynu zapalnego i mogą być wielokrotnie stosowane in vivo

Pożądane właściwości nośników nie wirusowych:

• Biokompatybilność – brak toksyczności i immunogenności

• Łatwe w podawaniu klinicznym, bez powikłań genetycznych (mutagenności) i wywołania odpowiedzi układu odpornościowego

• Niewygórowanych koszt i prosty schemat syntezy

• Produkowany w dużej ilości z dużą wydajnością

• Wysoka wydajność transfekcji

• Stabilność w czasie przechowywania

Bariery uniemożliwiające stosowanie kompleksów DNA – syntetyczny nośnik w terapii:

• Bariery wewnątrzkomórkowe: błona komórkowa

• Endosomy

• Lizosomy

• Błona jądrowa

• Bariery zewnątrzkomórkowe:

• Komórki fagocytujące

• Macierz pozakomórkowa

• Enzymy trawienne

Warunki zajścia transfekcji:

• Zdrowe, wolne od mykoplazm komórki

• Produkty nietoksyczne dla komórek

• Dobrze oczyszczony DNA i RNA

• Właściwie dobrane metody transfekcji

Warunki udanego transferu genów do komórki:

• Dostarczenie DNA do powierzchni komórki

• Związanie się kompleksu zawierającego DNA do błony komórkowej

• Przejście kompleksu przez błonę

• Przejście DNA przez cytoplazmę

• Wejście DNA do jądra komórkowego

• Umiejscowienie się DNA w odpowiednim miejscu w jądrze komórkowym

Bariera wewnątrzkomórkowa – lipopleksy i polipleksy łączą się z daną komórką za pomocą oddziaływań ujemnie naładowanych proteoglikanów na powierzchni komórki lub receptorów do ligandu.

Transfekcja jest wykorzystywana do:

• Badań biochemicznych

• W badaniach ekspresji genów kontroli procesów komórkowych

• Produkcji specyficznych białek

• W terapii genowej

• Uzyskiwania organizmów transgenicznych

Sposoby wnikania transgenu do komórki:

• Pasywne – plazmidowy DNA może biernie wnikać do jądra komórkowego, podczas jego podziału, stąd łatwość transfekowania komórek intensywnie dzielących się

• Aktywne – plazmidowy DNA związany z białkiem lub z inną cząsteczką zawierającą sygnał lokalizacji jądrowej rozpoznawany jest przez receptory jądrowe z rodziny importyn

Bariera pozakomórkowa – wpływ surowicy

W obecności osocza krwi (in vitro i in vivo) kompleksy o wypadkowym ładunku dodatnim maja utrudniony dostęp do tkanki docelowej.

Przyczyny:

• Agregacja wprowadzonych kompleksów w surowicy

• Duży dodatni ładunek odpowiedzialny za niespecyficzne oddziaływanie z macierzą zewnątrzkomórkową, powierzchnią wielu komórek, białkami osocza

• Opłaszczanie kompleksów przez białka osocza – oponiny

Czynniki wpływające na efektywność transfekcji:

• Obecność antybiotyków:

• Mogą zostać przeniesione do wnętrza komórki przez czynniki transfekcyjne

• Przenoszone kompleksy mogą oddziaływać z antybiotykami

• Obecność surowicy, ale także brak surowicy może spowodować, że liposomy są bardziej toksyczne dla komórek

Zalety transfekcji komórek w pożywkach bez surowicy:

• Eliminuje niekorzystne działanie surowicy

• Stwarzają możliwość zastosowania pożywek selektywnych – korzystne do selekcji hodowli pierwotnych

• Regulują proliferację i różnicowanie – można na przykład modulować ilość i jakość czynników wzrostowych

Wady transfekcji komórek w pożywkach bez surowicy:

• Różnorodność pożywek – dla każdej linii jest inna pożywka

• Selektywność – mogą zostać wyizolowane podszczepy w obrębie jednej linii

• Ściśle określony skład pożywki – usunięcie surowicy pozbawia hodowlę czynników protekcyjnych

• Proliferacja komórek w tego typu pożywkach jest zwykle wolniejsza

Zmiany procedury pasażowania w hodowlach komórek bez surowicy:

• Może zaistniej konieczność dodania do naczynia hodowlanego czynników zwiększających adhezję, np. polilizyny, firbronektyny

• Do przerwania działania surowicy trzeba używać jej inhibitorów – nie ma surowicy

• Trypsyna musi być słabsza, czyli bardziej rozcieńczona

• Komórki mogą być bardziej wrażliwe na działanie trypsyny

Sprawdzanie wydajności transfekcji – do sprawdzania wydajności transfekcji wykorzystywane są geny reporterowe, które są naturalnie obecne w komórkach transfekowanych.

Najczęściej używane geny reporterowe:

• CAT – acetylotransferaza chloramfenikolu

• Lucyferaza

• β – galaktozydaza

• Zielone białko fluorescencyjne GFP

Selekcja komórek transfekowanych

Selekcja komórek transfekowanych – geny selekcyjne np. transfekowane genami odporności na antybiotyk:

• Transfekcja plazmidem zawierającym geny oporności na neomycynę

• Hodowla komórek w pożywce zawierającej neomycynę

• Komórki nie strasfekowane nie produkują enzymu rozkładającego neomycynę

• Przeżywają komórki stabilnie stransfekowane posiadające gen selekcyjny – oporności na neomycynę

Metody selekcji komórek:

Cloning – metoda ta służy wyselekcjonowaniu klonu komórek o konkretnych właściwościach – danego typu (ponieważ do dominacji w hodowli mają tendencje komórki niewyspecjalizowane, jak na przykład firbroblasty)

1. Izolacja – cloning komórek wyspecjalizowanych danego typu – wyjściowa mieszanina populacji komórek

2. Przerośnięcie hodowli komórkami niewyspecjalizowanymi – cloning jest prosty w przypadku linii komórkowych ciągłych. Jest trudny w przypadku linii komórkowych pierwotnych, ponieważ mamy do czynienia ze zjawiskiem life – span.

• Cloning komórek przyczepionych do podłoża dokonuje się w szalkach Petriego, płytkach wielodołkowych lub butelkach.

• Cloning komórek rosnących w zawiesinie przeprowadza się umieszczając komórki w agarze lub innym materiale (methocel) – materiał ten oddziela komórki tworzące poszczególne kolonie.

Cloning jest rutynową metodą, którą rozdziela się komórki po transfekcji/transformacji.

1. Cloning metodą rozcieńczania (Puck and Marcus 1955):

• Najpowszechniej stosowana, najprostsza technika

• Oparta na obserwacji – komórki rozcieńczone poniżej pewnej gęstości rosną tworząc kolonie (tzw. wzrost klonalny)

1. Metoda Cloning rings:

W szalce Petriego można fizycznie izolować poszczególne kolonie, za pomocą tzw. cloning rings – szklanych, plastikowych, ceramicznych lub metalowych.

Czynniki wykorzystywane w metodzie cloning:

• Media selektywne , np. Ham’s FIZ – komórki mięśniowe

• Media kondycjonowane – są to pożywki, w których rosły inne komórki, zawierające składniki przez nie produkowane

• Hormony

  • Insulina 1x10^-10 iU/mL

  • Dexamethason

• Substraty matrix pozakomórkowego do pokrywania naczyń

  • Polilizyna 1 mg/ml

  • Fibronektyna 5 µg/ml

Planting efficiency – wydajność wysiewania komórek:

• Planting – wysiewanie zawiesiny komórkowej

• Wydajność plantingu – ilość komórek tworzących kolonie

• Komórki transfekowane rosną szybko i mają wysoką planting efficiency nawet w zawiesinie

• Komórki prawidłowe rosną wolno i mają niską planting efficiency

Hodowla na warstwie odżywczej:

• Feeder layer – warstwa komórek nieproliferujących, o wstrzymanych podziałach komórkowych

• Komórki stanowiące feeder layer:

• Są wysiewane jako pierwsze

• Rosną bezpośrednio na dnie naczynia

• Wydzielają czynniki adhezyjne, wzrostowe, stymulujące proliferację innych komórek

• Najczęściej jako warstwę odżywczą stosuje się fibroblasty lub komórki epitelialne

Przygotowanie warstwy odżywczej – wzrost komórek hamuje się przed osiągnięciem konfluencji poprzez napromieniowanie promieniami X lub gamma lub dodanie do hodowli nitomycyny C – związek hamujący transkrypcję.

Cloning komórek rosnących w zawiesinie:

• Metoda stosowana do otrzymywania komórek hematopoetycznych

• Kolonie są utrzymywane i otoczone przez sztywny materiał

• Kolonie formują się między agarem a methocelem

Pytania

Grupa I

1. Wymienić typy hodowli organotypowych

2. Hodowla z zastosowaniem insertów

3. Opisać metodę Trowell'a

4. Zastosowanie barwienie ORO

5. Dlaczego neurony pobiera się z płodów?

6. Opisać warunki hodowli neuronów

7. Opisać wyprowadzenie linii komórkowych z aorty

8. Etapy zapłodnienia in vitro

Grupa II

1. Typy hodowli organotypowej

2. Przykłady wykorzystania hodowli organotypowej na granicy faz

3. Co wiesz o hodowli eksplantów

4. Co wiesz o pasażowaniu neuronów

5. Rodzaje komórek nerwowych i różnice

6. Barwienie ORO – wykorzystanie

7. Izolacja komórek nerkowych

8. Wykorzystanie zapłodnienia metod in vitro

Grupa I’

1. Wymienić metody sterylizacji

2. Do czego służy czerwień fenolowa(pH)

3. Co to jest pasaż

4. Schemat pasażowania komórek przyczepionych do podłoża

5. Obliczenia z antybiotyku

6. Dezynfekcja antyseptyka sterylizacja

7. Porównać naczynia hodowlane

8. Opisać metodykę liczenia komórek

Grupa II’

1. Porównaj hodowlę pierwotną z linią komórkową.

2. Wymień znane Ci metody określania poliferencji hodowli

3. Opisz fazy wzrostu hodowli.

4. Wymień rodzaje hodowli.

5. Opisz metodę hodowli na granicy faz (Trowela)