Spektrofotometria absorpcyjna
Metody spektroskopowe opierają się na oddziaływaniu promieniowania elektromagnetycznego z materią. Można je podzielić na absorpcyjne i emisyjne, metody spektroskopowe są znacznie bardziej precyzyjne od tradycyjnych, znalazły one zastosowanie w analizie jakościowej i ilościowej większości składników żywności.
Promieniowanie elektromagnetyczne jest postacią energii, może być traktowane zarówno jako fala rozchodząca się w przestrzeni, jak i strumień cząstek, fotonów.
Fotony są cząstkami pozbawionymi ładunku i masy spoczynkowej, ich własnością jest właśnie energia(E): E=h*v, gdzie h-stała Plancka(6,626*10-34J*s), v-częstotliwość drgań[Hz]
Fala elektromagnetyczna porusza się ze stałą prędkością(c), wynoszącą w próżni 2,997925*108m*s-1, podstawowe wartości charakteryzujące ją to: długość fali promieniowania, liczba falowa, częstotliwość drgań i energia promieniowania.
Długość fali(λ) jest to odległość między dwoma odpowiadającymi sobie stanami fali, na przykład miedzy dwoma punktami szczytowymi fali. Jest to więc odcinek drogi promieniowania, na którym mieści się jedno drganie, jednostki: mikrometr, nanometr, femtometr. Odwrotnością dł. fali jest liczba falowa, określająca liczbę fal mieszczących się na odcinku 1cm.
Częstotliwość(v) jest to liczba drgań fali elektromagnetycznej w ciągu 1s. Wyraża się ją w hercach, a jej związek z dł. fali jest następujący: v=c/ λ
Energia promieniowania – warunkuje oddziaływania miedzy promieniowaniem a materią. Promieniowanie o większej energii ma mniejszą dł. fali: E=h*v=h* c/ λ
Promieniowanie podczerwone – jest absorbowane wtedy, gdy jego energia odpowiada charakterystycznym częstotliwościom drgań cząsteczek, absorpcja powoduje efekty oscylacyjne i rotacyjne.
Elektrony pochłaniające promieniowanie, przechodzą ze stanu podstawowego do wzbudzonego
Fale elektromagnetyczne o większej od nadfioletu energii powodują przejścia elektronowe na powłokach wewnętrznych.
W zakresie UV-VIS absorpcja wiąże się z przejściami elektronów walencyjnych, czyli sigma i pi, oraz wolnych par elektronowych. Elektrony z orbitali wiążących muszą przejść na swoje orbitale antywiążące wzbudzone, a elektrony n, w zależności od zaabsorbowanej energii, przechodzą na dowolny orbital antywiążący.
Chromofory – grupy funkcyjne, które ze względu na swoją strukturę elektronową umożliwiają odpowiednie przejście i w efekcie powodują absorpcję promieniowania z zakresu UV-VIS.
Jeśli wiązania podwójne w cząsteczce nie są izolowane, lecz sprężone, to orbitale cząsteczkowe nakładają się i powstają 2 orbitale wiążące i 2 antywiążące. W efekcie mamy do czynienia z mniejszą różnicą energii przy przejściu na najbliższy orbital wzbudzony, co powoduje silniejszą absorpcję przy większej długości fali.
Podstawniki, które powodują zmianę długości fali absorbowanego promieniowania lub intensywność absorpcji chromoforów, nazywane są auksochromami., do auksochrmów należy grupa hydroksylowa i aminowa, ich występowanie powoduje przesunięcie czerwone absorbowanej długości fali.
Spektrometria UV-VIS – wykorzystując światło widzialne, można mierzyć bezpośrednio tylko substancje barwne, możliwy jest także pomiar związków bezbarwnych, lecz po przeprowadzeniu reakcji chemicznej.
Źródło promieniowania – za względu na konieczność pokrycia całego typowego zakresu UV-VIS, czyli od 200nm do 800nm, w aparatach stosowane są albo 2 różne źródła promieniowania albo też jedna lampa, dająca promieniowanie w całym potrzebnym zakresie dł. fali.
Monochromator – jest elementem spektrofotometru, który z wiązki ciągłego promieniowania emitowanego przez źródło wydziela wąski zakres o wybranej dł. fali. Ma on zazwyczaj formę komory ze szczelinami wejściową i wyjściową, siatką dyfrakcyjną rozszczepiającą promieniowanie i kolimatorem.
Komory pomiarowe – wyposażone są w odpowiedni uchwyt oraz kuwetę pomiarową, kuwety powinny mieć znana szerokość, być odporne na analizowane substancje i ich rozpuszczalniki oraz w minimalnym stopniu wpływać na stosowane promieniowanie, do pomiarów w ultrafiolecie wykorzystuje się kuwety wykonane ze szkła kwarcowego
Detektory – promieniowania są urządzeniami pozwalającymi zamienić energię docierającego do nich promieniowania elektromagnetycznego na sygnał elektryczny. Powinny wykazywać dużą czułość przy niskim poziomie szumów oraz szeroki zakres liniowości przetwarzania sygnału optycznego na elektryczny
W celu rejestracji sygnału należy zmierzyć powstały w detektorze prąd elektryczny, np. za pomocą galwanometru i przetworzyć w sygnał cyfrowy.
Spektrofotometry IR – źródłem promieniowania w podczerwieni jest żarzące cię ciało stałe, np. włókno Nersta, do wykonania elementów optycznych przyrządów stosuje się sztucznie wyhodowane kryształy jonowe.
Prawo Lamberta-Beera – mówi że absorbancja roztworu jest wprost proporcjonalna do grubości jego warstwy i stężenia substancji absorbującej.
Absorbancja, log(I0/I) jest wartością niemianowaną więc jednostka współczynnika absorpcji musi być tak dobrana, by znosiła jednostki dwóch pozostałych wartości w równaniu, stężenie podaje się w molach na decymetr sześcienny, grubość w centymetrach.
Właściwy współczynnik – masa absorbującego składnika zawarta w pewnej jednostce objętości: A=a*c*I
Transmitancja – jest miarą przepuszczalności układu dla promieniowania elektromagnetycznego, wyrażana jest na ogół w % i liczona ze stosunku natężenia promieniowania przepuszczonego do padającego T=I/I0
Pomiary ilościowe dokonywane są w spektrofotometrii w następujących etapach:
- wyznaczenie analitycznej dł. fali dla analizowanej substancji. Jest to taka dł. fali promieniowania, przy której wartość absorpcji jest największa i którą stosuje się do pomiarów ilościowych. Wyznacza się ją przez pomiar absorbancji przy różnych długościach fali dla roztworu o stałym stężeniu i wybór dł. fali odpowiadającej maksimum przebiegu krzywej.
- sprawdzenie czy w badanym zakresie stężeń układ stosuje się do prawa Lamberta-Beera
- wykreślenie krzywej wzorcowej lub wyznaczenie współczynnika absorbancji do metody algebraicznej
- pomiar oznaczonej próbki, jeśli się prowadzi reakcję barwną, to należy zwrócić uwagę na możliwy wpływ czasu prowadzenia reakcji na intensywność powstałego zabarwienia
- obliczenie wyników przy użyciu równania krzywej wzorcowej lub znanego współczynnika absorpcji analizowanej substancji
Metoda spektrofotometrycznego oznaczania żelaza III – polega na przeprowadzeniu reakcji barwnej jonów żelaza z wytworzeniem czerwonego zabarwionego tiocyjanianu żelaza i pomiarze jego absorbancji.