Paulina Plesner 193333 15.04.2014

Joanna Ratajczyk 191837 29.04.2014

Gr. 6 wt. 13:15

LABORATORIUM Z INŻYNIERII GENETYCZNEJ

ĆWICZENIE NR VI

„Ekspresja domeny wiążącej DNA receptora ekdysteroidowego (EcRDBD) z plazmidu pGEX-2T (pGEX-2T/EcRDBD), w komórkach Escherichia coli szczepu XL1-Blue oraz indukcja ekspresji EcRDBD.”

ĆWICZENIE NR VII

„Analiza białkowych produktów ekspresji z wektora pGEX-2T i pGEX-2T/EcRDBD w poliakryloamidowym żelu denaturującym w układzie nieciągłym wg Laemlli’ego (SDS-PAGE).”

1. Cel ćwiczenia :

• ĆWICZENIE VI:

• Ekspresja domeny wiążącej DNA receptora ekdysteroidowego z plazmidu pGEX-2T w komórkach E. coli szczepu XL1-Blue

• Indukcja ekspresji EcRDBD

• ĆWICZENIE VII:

• Analiza białkowych produktów ekspresji z wektora pGEX-2T i pGEX-2T/EcRDBD w poliakryloamidowym żelu denaturującym w układzie nieciągłym wg Laemlli’ego (SDS-PAGE)

Protokół:

• ĆWICZENIE VI:

• Z płytki po ligacji pobrano kilka kolonii, każdą z nich zainokulowano 3 ml pożywki płynnej LB zawierającej karbenicylinę w stężeniu końcowym 50 µg/ml.

• Uzyskane w ten sposób kultury inkubowano w temperaturze 37°C przez 12 h na wytrząsarce rotacyjnej przy 182 obr/min.

• Następnie wyizolowano plazmidowe DNA z 1,5 ml przygotowanych hodowli bakteryjnych oraz zidentyfikowano klony zawierające wektor z insertem wklonowanym w poprawnej orientacji, wykorzystując trawienie klonów rekombinowanych plazmidu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i/lub technikę PCR.

• Bakterie szczepu XL1-Blue transfekowane odpowiednim plazmidem, w który wklonowano pożądany fragment DNA, wysiano na płytkę LB z karbenicyliną (w stężeniu końcowym 50 µg/ml).

• Inkubowano w temperaturze 37°C przez 12 h

• Z płytki pobrano 1 kolonię i zaszczepioną nią 10 ml pożywki płynnej LB, zawierającej karbenicylinę.

• Kultury inkubowano w temperaturze 37°C przy 182 obr/min. aż do pojawienia się wyraźnego zmętnienia (około 12 h).

• Do kontroli warunków ekspresji przygotowano także w analogiczny sposób hodowlę komórek XL1-Blue transformowanych wyjściowym plazmidem pGEX-2T.

• Z przygotowanych hodowli starterowych (opisanych powyżej) pobrałyśmy po 6ml zawiesiny komórek XL1-Blue transformowanych wektorem pGEX-2T i przeniosłyśmy je do dwóch osobnych kolb, zawierających każda po 50 ml świeżego medium LB z karbenicyliną w stężeniu końcowym 50 µg/ml.

• Kolby inkubowałyśmy w temperaturze 37°C przy 182 obr/min do momentu aż gęstość optyczna hodowli, którą mierzyłyśmy przy λ=600nm, osiągnęła wartość 0,4-0,6 (dokładnie absorbancja wyniosła 0,7 ).

• Po uzyskaniu odpowiedniej wartości OD₆₀₀ z obu kolb pobrałyśmy po 1ml hodowli, odwirowałyśmy w wirówce Eppendorfa, odrzuciłyśmy supernatant, a osad bakterii zawiesiłyśmy w 100µl 2xSB (dwukrotnie stężony bufor do nanoszenia próbek na żel).

• Przygotowane w ten sposób próbki NI/1 (z hodowli z wektorem pGEX-2T/EcRDBD) oraz NI/2 (z hodowli z wektorem pGEX-2T) zamroziłyśmy w -20°C.

• Następnie do obu kolb dodałyśmy 26 µl ZnCl₂ oraz taką sama objętość IPTG.

• Kontynuowałyśmy inkubację w temperaturze 37°C przy 182 obr/min.

• W czasie trwania inkubacji pobierałyśmy po 1 ml próbki wg poniższego schematu:

Hodowla z pGEX-2T/EcRDBD	Hodowla z pGEX-2T	Czas pobrania [min]
A	-	15
B	-	30
C	-	60
D1	D2	90

NIE PAMIĘTAM JAK BYŁO Z TYMI ABSORBANCJAMI POWYŻEJ 0,7 !!!

• Do pobranych zawiesin komórkowych po odwirowaniu i usunięciu supernatantów dodałyśmy 100 µl 2xSB.

• Wszystkie próbki zamroziłyśmy w -20°C.

• ĆWICZENIE V:

1. Przygotowanie żeli poliakryloamidowych (rozdzielającego i zagęszczającego)

• 12% żel poliakryloamidowy (PAG) rodzielający:

- zmieszałyśmy 2,5 ml Lower Tris-HCl (o pH = 8,8) ze 100 µl SDS (10%) i z 3,34 ml H₂O.

- następnie do tak przygotowanej mieszaniny dodałyśmy 50 µl APS ((NH₄)₂S₂O₈) oraz 10 µl TEMED.

- tak przygotowany żel wylałyśmy pomiędzy dwie szklane płytki przedzielone przekładkami i połączone klamerkami, pozostawiając odpowiednią ilość miejsca w celu późniejszego wylania żelu zagęszczającego oraz włożenia grzebienia.

- po wylaniu roztwór żelu ostrożnie zalałyśmy wodą i tak przygotowany żel pozostawiłyśmy do polimeryzacji (na około 30 min).

- po upływie czasu polimeryzacji zlałyśmy roztwór znad żelu, po czym żel przepłukałyśmy wodą (w celu usunięcia resztek niespolimeryzowanego akryloamidu).

• 4% żel poliakryloamidowy (PAG) zagęszczający:

- zmieszałyśmy 1,75 ml Upper Tris-HCl (o pH = 6,8) z 70 µl SDS (10%) i z 4,205 ml H₂O.

- następnie do tak przygotowanej mieszaniny dodałyśmy 35 µl APS ((NH₄)₂S₂O₈) oraz 7 µl TEMED.

- tak przygotowany żel bezpośrednio wylałyśmy na żel rozdzielający, a następnie delikatnie wsunęłyśmy grzebień, uważając by nie powstały pęcherzyki powietrza, które przeszkadzałyby podczas rozdziału elektroforetycznego.

- ponownie pozostawiłyśmy żel do polimeryzacji (na około 30 minut).

- gdy żel spolimeryzował delikatnie usunęłyśmy grzebień i umieściłyśmy go w aparacie do elektroforezy i zalałyśmy 5x stężonym buforem do elektroforezy.

1. Przygotowanie próbek do rozdziału elektroforetycznego:

• Próbki białek bakteryjnych przygotowane w ćwiczeniu nr VI poddałyśmy denaturacji poprzez 5 minutową inkubację w temperaturze 95°C w termomikserze.

• Następnie próbki odwirowałyśmy w wirówce Eppendorfa przy 13400xg przez 10 min.

1. Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym:

• Przygotowane próbki naniosłyśmy na studzienki w żelu poliakryloamidowym w objętości 10 µl, natomiast zastosowany marker był użyty w objętości 5µl.

• Do zewnętrznych studzienek naniosłyśmy po 10 µl buforu aby uniknąć powstania „uśmiechniętego żelu”.

• Próbki były naniesione w kolejności przedstawionej poniżej:

• Elektroforezę przeprowadziłyśmy w buforze do elektroforezy przy natężeniu 30 mA przez 75 minut.

• Po przeprowadzonej elektroforezie przez 20 h przeprowadzono barwienie żelu po czym przez 18h odbarwienie żelu.

1. Wyniki:

1. Obliczenia:

$$Rf = \frac{x}{y}$$

Gdzie:

Rf − wskaznik retencji

x − odleglosc przebyta przez substancje rozdzielana

y − odleglosc przebyta przez czolo rozpuszczalnika

$$\text{Rf}_{1} = \frac{x_{1}}{y} = \frac{3}{100} = 0,03$$

$$\text{Rf}_{2} = \frac{x_{2}}{y} = \frac{12}{100} = 0,12$$

$$\text{Rf}_{3} = \frac{x_{3}}{y} = \frac{26}{100} = 0,26$$

$$\text{Rf}_{4} = \frac{x_{4}}{y} = \frac{38}{100} = 0,38$$

$$\text{Rf}_{5} = \frac{x_{5}}{y} = \frac{52}{100} = 0,52$$

$$\text{Rf}_{6} = \frac{x_{6}}{y} = \frac{69}{100} = 0,69$$

$$\text{Rf}_{7} = \frac{x_{7}}{y} = \frac{79}{100} = 0,79$$

y = -1,0993x + 1,9958

LogMW = -1,0993 Rf + 1,9958

pGEX-2T: GST-EcRDBD $\mathbf{\text{\ \ \ \ }}\text{Rf}_{\text{GST} - \text{EcRDBD}} = \frac{36}{100} = 0,36$

pGEX-2T: GST $\text{Rf}_{\text{GST}} = \frac{50}{100} = 0,5$

LogMW_{GST − EcRDBD} = −1, 0993 • 0, 36 + 1, 9958 = 1, 600052

MW_{GST − EcRDBD} = 39, 82 kDa

LogMW_GST = −1, 0993 • 0, 5 + 1, 9958 = 1, 44615

MW_GST = 27, 94 kDa

1. Wnioski:

• Celem ćwiczenia VI była indukcja ekspresji domeny wiążącej DNA receptora ekdysteroidowego z plazmidu pGEX-2T. Na początku pobieraliśmy kolonie uzyskane po ligacji i zawieszaliśmy w pożywce z LB oraz karbenicyliną , ponieważ odpowiednio wysokie stężenie antybiotyku powoduje zwiększenie presji na replikację. Następnie przygotowaliśmy odpowiednie hodowle i inkubowaliśmy do uzyskania OD₆₀₀ w granicach 0,4-0,6 , które określa nam gęstość optyczną i właściwą fazę wzrostu (wzrost logarytmiczny komórek). Z otrzymanych w ten sposób hodowli przygotowałyśmy próbki, do których dodałyśmy ZnCl₂ i IPTG, aby przeprowadzić indukcję ekspresji domeny wiążącej DNA. Chlorek cynku bierze udział w tworzeniu palców cynkowych, a także dostarcza potrzebne jony do prawidłowego działania enzymu. ZnCl₂ dodaliśmy również do kontroli ponieważ musi ona mieć skład podobny do hodowli. Natomiast IPTG dodajemy w celu związania represora. Jest on induktorem wiążącym się z promotorem hybrydowym tac ( P_tac ) , który kieruje transkrypcja genów rekombinowanego białka. W wyniku czego w badanej próbie powoduje on nadekspresję białek fuzyjnych GST-EcRDBD, natomiast w próbie kontrolnej nadekspresję glutationo-S-transferazy (GST). Z pobranych zawiesin komórkowych odrzuciliśmy medium, ponieważ źle ono wpływa na lizę, a osad zawiesiliśmy w buforze SB, którego składniki miały następujący wpływ:

- TRIS-HCl – zapewnia odpowiednie pH

- SDS - został użyty w celu denaturacji białek poprzez ich destabilizację co prowadzi do lizy. Sprowadza białko do formy pseudo-liniowej i nadaje mu ładunek ujemny proporcjonalny do danej cząsteczki.

- β-markaptoetanol – związek redukujący cysteinę, co chroni moduły palców cynkowych przez zniszczeniem oraz redukcja mostków disiarczkowych.

- glicerol – powoduje zagęszczenie próbki,

- błękit bromofenylowy – nie wchodzi w reakcje z białkiem , jest indykatorem elektroforezy SDS-PAGE. Zapewnia warunki redukujące, aby białko zredukować do formy nie posiadającej mostków disiarczkowych powstałych u bakterii.

• W ćwiczeniu VII natomiast przeprowadzaliśmy elektroforezę białek na żelu poliakrylamidowym w układzie Laemmli’ego (SDS-PAGE). Rozdział SDS-PAGE prowadzony jest na ogół techniką nieciągłego żelu, w którym stosuje się bufor elektroforetyczny w układzie tris-glicyna (tzw. układ Leammli’ego). W układzie tym pH żelu zatężającego wynosi 6,6, zaś żelu rozdzielającego 8,8. Jony chlorkowe pochodzące z TRIS-HCl oraz jony glicynianowe biorą udział w zagęszczaniu analizowanych białek w żelu zatężającym. pH żelu zatężającego jest nieznacznie wyższe niż punkt izoelektryczny glicyny. Dlatego większość glicyny ma postać jonów obojnaczych, nie migrujących w polu elektrycznym. Tylko niewielka ich część posiada w danym momencie sumaryczny ładunek ujemny i migruje w kierunku anody powoli jako tzw. „jon opóźniony”. Natomiast aniony chlorkowe, posiadające wysoką ruchliwość elektroforetyczną, przemieszczają się z dużą szybkością w kierunku anody jako tzw. „jon wiodący”. Rozdzielenie się dwóch „chmur” jonów powoduje spadek napięcia pomiędzy nimi, co powoduje, że zawarte między nimi białka ulegają silnej kondensacji w bardzo wąskim paśmie. Dzięki temu wszystkie białka wchodzą w żel rozdzielający praktycznie w tym samym czasie. W żelu zatężającym stosuje się na tyle niskie stężenie poliakrylamidu, aby nie zaburzał on migracji białek. Jego funkcja sprowadza się do ograniczania dyfuzji molekuł i hamowania ruchów konwekcyjnych. Po dotarciu próbki do żelu rozdzielającego zachodzi gwałtowna zmiana w otoczeniu migrujących białek. Ponieważ pH żelu rozdzielającego jest znacznie powyżej pI glicyny (pH = 8,8), praktycznie całość glicyny ulega deprotonacji i jako aniony wyprzedza białka. Powoduje to zanik miejscowego spadku napięcia. Od tego momentu białka rozdzielane są ze względu na swoja masę cząsteczkową [3].

Wykorzystując SDS musimy pamiętać ,że jeżeli białko posiada silne hydrofobowe rdzenie to SDS nie rozwinie go do końca. Dlatego potrzebne są dodatkowe sposoby denaturacji jak na przykład denaturacja termiczna.

- APS- nadsiarczan amonu – generuje wolne rodniki

- TEMED – tetraetylometylodiamina- przyspiesza tworzenie wolnych rodników , w wyniku czego następuje łączenie się monomerów i polimeryzacja.

• Na podstawie analizy otrzymanych wyników możemy stwierdzić iż prowadzone przez nas od pierwszych zajęć czynności dały oczekiwane rezultat. Wykres zależności - ruchliwości elektroforetycznej białek markera od logarytmu ich masy cząsteczkowej wykazuje, że jest on odwrotnie proporcjonalny. Z obrazu przeprowadzonej elektroforezy SDS-PAGE i sporządzonego wykresu , możemy określić porównując ruchliwość elektroforetyczną markera i naszego produktu jego masę , a także położenie . W ten sposób otrzymaliśmy białko fuzyjne GST-EcRDBD o masie 39,82 kDa oraz w kontroli glutationo-S-transferazę (GST) o masie 27,94 kDa .

LITERATURA:

[1] Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z Inżynierii genetycznej, „Przygotowanie komórek kompetentnych XL1-Blue (Cohen, 1972; Sambrook& Russell, 2001)” , Ćwiczenie nr IV, semestr letni 2014.

[2] Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z Inżynierii genetycznej, „ Ligacja wektora pGEX-2T zlinearyzowanego enzymem BamHI i defosforylowanego (pGEX-2T/BamHI) z fragmentem DNA kodującym domenę wiążącą DNA wektora ekdysteroidowego ( EcRDBD/BamHI) przy użyciu ligazy T4.”, Ćwiczenie nr V, semestr letni 2014.

[3] Źródło internetowe : http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/SDS-PAGE/, 23-07-2011

[4] Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer: "Biochemia", Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2011