MIKROBIOLOGIA – Ćwiczenia 1

1. Kształty i wielkości komórek bakteryjnych i komórek grzybów.

BAKTERIE

l)

Kuliste (0,8 – 1,2 µm)

a. ziarniak (coccus),

b. dwoinka (diplococcus),

c. czworak,

d. paciorkowiec (streptococcus),

e. pakietowiec (sarcina),

f. gronkowiec (staphyloccocus).

Cylindryczne (1,5 – 10 µm)

g. pałeczka (bacterium),

h. laseczka z przetrwalnikami (bacillus).

Spiralne(3 - 30µm)

i. przecinkowiec (vibrio), 

j. śrubowiec (spirillium),

k. krętek (spirochaete)

l. Promieniowce (Actinomycetales) (10-50 µm)

GRZYBY

• Jednokomórkowe, np. drożdże

• Komórczakowe, np. pleśniak

• Wielokomórkowe, które nie tworzą owocników, np. kropidlaki

• Wielokomórkowe tworzące owocniki zróżnicowane na trzon i kapelusz, np. borowik

1. Budowa morfologiczna bakterii i grzybów.

BAKTERIA

Osłona komórkowa:

Ściana komórkowa i błona cytoplazmatyczna -> mezosomy

Składniki cytoplazmy:

Chromosom bakteryjny = nukleoid = DNA

Plazmidy koniugacyjne i niekoniug. (DNA)

Rybosomy (70S: 30S i 50S)

Ciałka wtrętowe/zapasowe

Endospory

Składniki pozakomórkowe:

Otoczka

Rzęski/wici/flagella (antygen H)

Fimbrie/pili

Formy bakterii bez ściany komórkowej, które zachowują funkcje życiowe (przy ciśnieniu osmotycznym)

• Protoplasty (z bakterii Gram-dodatnich) <- aktywność lizozymu

• Sferoplasty (z bakterii Gram-ujemnych) <- hamowanie polimerazy

• Formy L (po kontakcie z antybiotykiem)

GRZYB

Komórki grzybów są eukariotyczne; zawierają jądro komórkowe, mitochondria, struktury Golgiego, E.R., centriole i inne typowe organelle, nie zawierają natomiast plastydów i typowo roślinnych materiałów zapasowych, np. skrobi. W ścianach komórkowych u zdecydowanej większości odkłada się chityna – aminocukier, a materiałem zapasowym jest glikogen oraz rzadziej tłuszcz, wszystkie wymienione związki są charakterystycznymi produktami zwierząt.

Komórki grzybów nigdy nie zawierają chlorofilu, ale wiele gatunków wytwarza inne, nieczynne fotosyntetycznie barwniki nadające plesze zabarwienie.

• Grzybnia – ciało (plecha) grzyba. Jej strzępki rozgałęziają się w ściółce na kilkaset metrów. Strzępki to podstawowe elementy budowy grzyba. Mają kształty nitek, sznurów. Czasem zbijają się w szerokie elementy takie jak trzony i kapelusze

• Owocnik to część grzyba, na której powstają zarodnie. Wyróżniamy kilka typów owocników, ze względu na ich kształt: owocnik kapeluszowy np. borowik, zamknięty (wnętrzniak) np. purchawka, tęgoskór, miseczkowaty np. czarka, dzierżka

• Hymenofor to część grzyba, gdzie rozmieszczone są zarodnie. Może mieć kształt: rurkowaty np. u borowika, kolczasty np. sarniaka, blaszkowaty np. u muchomorów.

• Zarodnie to część grzyba, gdzie powstają zarodniki.

• Zarodniki inaczej spory rozprzestrzeniają grzyby w nowe miejsca

1. Genetyka bakterii.

MULTIPLIKACJA BAKTERII:

• Podział prosty poprzeczny

• Cykl złożony (ciałka elementarne i siatkowate u chlamydii)

• Formy L – mogą dawać objawy zakażenia

MATERIAŁ GENETYCZNY BAKTERII:

• Chromosom bakteryjny = nukleoid (4 tys. genów)

• Plazmidy (40-50 genów)

- koniugacyjne/duże i niekoniugacyjne/małe

• Transpozyny oflagowane sekwencjami włączonym IS (fragmenty DNA mogące przemieszczać się)

MUTACJE BAKTERYJNE:

Pochodzenie

1. Mutacje spontaniczne (błędy replikacji, zmiany w DNA; korzystne – odwrócone lub nie)

2. Mutacje doświadczalne (radiacyjne, chemiczne)

Rodzaje mutacji:

• Punktowe (nieme, zmiany sensu)

• Fazy odczytu (zmiany sensu, nonsensowne)

• Odkształcające helisę DNA (T=T)

MECHANIZMY NAPRAWY MUTACJI:

• Naprawa z udziałem świtała (fotoliza rozdziela T=T); bezbłędna

• Naprawa bez udziału światła (endonukleaza -> polimeraza DNA -> ligaza); bezbłędna

• Naprawa za pomocą glikozydazy (po uszkodzeniu mutagenem); bezbłędna

• Poreplikacyjna naprawa rekombinacyjna ( odkształcenie helisy przy widełkach replikacyjnych); bezbłędna

• Naprawa SOS (gdy są masywne uszkodzenia T=T w obydwu niciach); podatna na błędy.

PRZEKAZYWANIE DNA MIĘDZY BAKTERIAMI:

a) Koniugacja - polega na przeniesieniu plazmidu lub części genoforu z jednej komórki bakteryjnej do drugiej za pomocą specjalnych wypustek płciowych zwanych fimbriami. Podczas tego procesu biorca może uzyskać nowe geny, a co za tym idzie nowe cechy takie jak np.: odporność na antybiotyk.

b) Transformacja - polega na pobraniu przez bakterie DNA znajdującego się w podłożu. Geny zawarte na pobranych cz. DNA często ulegają ekspresji w stransformowanych komórkach.

c) Transdukcja - polega na przeniesieniu fragmentów DNA z jednej kom. do drugiej za pomocą wirusów.

GENETYCZNE PODSTAWY PATOGENNOŚCI BAKTERII

• Geny chromosomu bakteryjnego -> stałe cechy (otoczki, enzymy)

• Geny plazmidowe -> zmienna dystrybucja (egzotoksyny, adhezyjny)

• Przekazywanie genów zjadliwości (lizogenia, transmisja plazmidów)

1. Enzymy bakteryjne

• Konstytucyjne i adopcyjne

• Hydrolazy (rozkład substancji organicznych) i dezmolazy (głęboki rozkład substancji organicznych)

• Wewnątrzkomórkowe (hydrolazy, transferazy, izomerazy, liazy, ligazy, fosforylazy)

• Zewnątrzkomórkowe – rozkład substratu do drobnych produktów, które Komorka może pobrać (lipazy, proteazy, hemolizyny, hialuronidazy, nukleazy)

• Oddechowe (oksydazy, enzymy cytochromowe, peroksydazy, dehydrogenazy)

Ważne szlaki biosyntezy bakterii:

• Synteza aminokwasów

• Synteza nukleotydów

• Synteza DNA i RNA

• Synteza białek

• Synteza peptydoglikanu.

1. Metabolizm komórki bakteryjnej

1. Składniki odżywcze będące budulcem

Autotrofy, hematotrofy, protofrofy, auksotrofy, źródła węgla, azotu, jony, czynniki wzrostowe.

1. Składniki odżywcze będące źródłem energii.

METABOLIZM ENERGETYCZNY

Ze względu na źródło energii:

• Litotrofy – donorami elektronów są: H₂, NH₃, H₂S, CO (zredukowane związki nieorganiczne)

• Organotrofy – donorami elektronów zredukowane związki organiczne (pirogronian, mleczan)

DROGI ROZKŁADU ZWIĄZKÓW CHEMICZNYCH:

• Oddychanie tlenowe – reakcje chemiczne dostarczają energii, gdy O₂ jest końcowym akceptorem energii (tak czerpią energię ścisłe tlenowce): 1mol Glu -> 38moli ATP

• Oddychanie beztlenowe – reakcje chemiczne dostarczają energii, gdy końcowym akceptorem energii są związki nieorganiczne inne niż O₂ (tak czerpią energię beztlenowe i względnie beztlenowe)

• Fermentacja – reakcje chemiczne dostarczają energii, gdy końcowym akceptorem energii są związki organiczne ( tak czerpią energię względne beztlenowce); 1mol Glu -> 2mole ATP

METABOLIZM BAKTERYJNY WYKORZYSTYWANY W DIAGNOSTYCE

Właściwości sacharolityczne

• Badamy rozkład węglowodanów (prostych, złożonych), glikozydów (es kulina), alkoholi (mannitol) w warunkach tlenowych i beztlenowych, z wytworzeniem gazu lub nie

• Produkty końcowe – kwasy organiczne, alkohole, ketony, estry, gazy (H₂S, H₂, CH₄)

• Szereg cukrowy: woda peptonowa z 1% cukru i z błękitem bromotymolowym (+ rurka Durhama)

• Podłoże Klinglera (1% glukozy, 10% laktozy, peptony + czerwień fenolowa)

• Odczyn MR w podłożu Clarka (czy produkty końcowe rokłsdu cukru są kwaśne czy obojętne)

• Odczyn VP (wykrywanie przemian węglowodanowych, gdzie powstaje acetylometylokarbinol

• Rozkład laktozy (podłoże SS, MC, Le); rozkład mannitolu (podłoże CH)

Właściwości proteolityczne

• Wytwarzanie proteaz

• Podłoże z żelatyną

• Upłynnianie ściętej surowicy

• Dezaminacja lub dekarboksylacja

• Wykrywanie NH₃ z użyciem odczynnika Nesslera (brunatnienie)

• Wykrywanie H₂S (rozkład cystyny, cysteiny, metioniny) – podłoże Klinglera (z octanem ołowiu), SS

• Wykrywanie uwalniania indolu z tryptofanu

• Wykrywanie wytwarzania ureazy ( na podłożu Christensena z mocznikiem)

Właściwości hemolityczne

Hemoliza α, β, γ.

1. Czynniki zjadliwości bakterii.

• Otoczki (uniknięcie opsonizacji i fagocytozy)

• Adhezyny (fimbrie, LPS, białko M i A)

• Czynniki inwazyjności (rozprzestrzenianie się między komórkami)

• Egzoenzymy (kolagenozy, hialuronidazy, fibrynolizyny, proteinazy, lecytynazy, β-laktamazy)

• Egzotoksyny (enterotoksyny, neurotoksyny, cytotoksyny)

• Endotoksyna (lipo polisacharyd ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych)

• Oporność na antybiotyki i dezynfektanty (geny chromosomalne i plazmidowe)

• Lizogenia – profag przekazuje gen kodujący toksynie

1. Różnice pomiędzy Eukariota a Prokariota.

Cecha	Prokariota	Eukariota
1. Wielkość 2. Błona jądrowa 3. Aparat genetyczny 4. Chromosomy 5. Histony 6. Podział 7. Kompartymenty błonowe 8. Ściana komórkowa 9. Fimbrie 10. Sporogeneza 11. Steroidy i Sterole 12. Rybosomy 13. RE 14. Centrum energetyczne 15. Wodniczki/wakuole 16. Oddychanie beztlenowe 17. Zróżnicowanie tkanek 18. Wiązanie azotu 19. Aminokwasy	1-10 µm Bark Nukleoid i plazmidy 1 Brak Prosty Brak Zbudowana z mureiny Tak Tak Brak 70S (30S + 50S) Bark Mezosomy Brak Tak Brak Tak D	10-100 µm Obecna Nukleus z jąderkiem 23 pary Związane z DNA Mitoza Obecne Bark (chityna, celuloza) Nie Nie Obecne 80S (40S + 60S) Obecne Mitochondria Obecne Nie Obecne Nie L

1. Barwienie bakterii, grzybów.

METODY BARWIENIA PREPARATÓW BAKTERYJNYCH

• Barwienie preparatów przyżyciowych

Błękitem metylowym, płynem Lugola

• Barwienie preparatów utrwalonych

• Barwienie proste – z użyciem jednego barwnika (kształt i układ komórek): fioletem krystalicznym lub gencjanowym, błękitem metylowym, fuksyną fenolową

• Barwienie złożone – kilka barwników (metoda Grama, Ziehl-Nieslena, Neiserra, Giemsy)

• Barwienie pozytywne – komórki zabarwione, tło bezbarwne (np. metoda Grama)

• Barwienie negatywne – komórki bezbarwne, tło zabarwione

• Barwienie pozytywno-negatywne (dla wizualizacji otoczek bakteryjnych)

• Specjalne metody barwienia (spor, rzęsek, ściany komórkowej, ciałek zapasowych)

TEORIE BARWIENIA: fizyczna i chemiczna.

PODSTAWOWE ZASADY IDENTYFIKACJI I KLASYFIKACJI BAKTERII

• Morfologiczne cechy hodowli(wzrost) i komórki (barwienie)

• Ocena aktywności metabolicznej (zapotrzebowanie na O₂, cukry, wytwarzane enzymy)

• Reaktywność serologiczna (rozpoznawanie determinant antygenowych – serotypowanie)

• Ocena stopnia spokrewnienia genetycznego (PCR, homologia kwasów nukleinowych – sondy)

• Próby biologiczne (testy na toksyczność)

Barwienie grzybów: Błękit laktofenolowy.

1. Metody wykrywania produktów przemian komórkowych i ich znaczenie w identyfikacji drobnoustrojów.

2. Podobieństwa i różnice w hodowli bakterii, wirusów i grzybów.

3. Warunki hodowli bakterii i grzybów, skład, właściwości podłoży bakteryjnych/wilgotność, pH, temperatura, środowisko gazowe, skład organiczny i nieorganiczny podłóż, czynniki wzrostowe.

HODOWLA BAKTERII

1. TEMPERATURA

• Psychrofile - poniżej 20^oC

• Mezofile – 20-45^oC

• Termofile – powyżej 45^oC

1. POTENCJAŁ OKSYDACYJNO-REDUKCYJNY (Eh) = TLENOWOŚĆ

Przy lepszym natlenieniu potencjały erdoks są dodatnie.

Przy gorszym natlenieniu potencjały erdoks są ujemne.

1. Bezwzględne tlenowce

2. Względne beztlenowce – oddychanie beztl. I tlenowe

3. Ścisłe anaeroby – fermentacja i oddychanie beztl.

4. Mikroaerofile – bakterie fermentacji mlekowej – stężenie O₂ niższe niż w atmosferze, a CO₂ wyższe

5. Aerotoleranty – krótko przezywają, nie rosną w obecności O₂

Beztlenowe metody hodowli bakterii

• Fizyczne – wypompowanie )2 (an aerostat) lub hodowla z tkanką zwierzęcą/roślinną absorbującą O2, hodowla pod parafiną, wysoki agar, eksykator

• Chemiczne – substancje wiążące O2 (podsiarczan sodu, alkaliczny roztwór trioksybenzenu) lub środki chemiczne redukujące O2 (kwas askorbinowy, cysteina, siarczan sodowy)

• Biologiczne – płytka Foertnera

1. ODCZYN ŚRODOWISKA

• Acidofile – bakterie fermentacji mlekowej – pH 2,5

• Neutrofile – większość patogenów człowieka - pH 6,5-7,5

• Alkalofile – pH 8-11

1. WYMAGANIA ODŻYWCZE (optymalny skład podłoża hodowlanego)

1. Związki węgla (budulec i źródło energii)

• Autotrofy (glony, niektóre bakterie) -> pobierają utlenione/nieorganiczne związki węgla, (CO₂ – fotoautotrofy, H₂CO₃ – chemoautotrofy)

• Heterotrofy (bakterie i grzyby) -> pobierają zredukowane/organiczne związki węgla

(chemotrofy) – cukry, aminokwasy, glicerol, kwas mlekowy)

• Auksotrofy – wymagają obecności w środowisku określonych związków organicznych

1. Azot

2. Tlen i wodór – woda to 50-90% podłoża mikrobiologicznego

3. Makroelementy

4. Mikroelementy

5. Czynniki wzrostowe

6. Składniki różnicujące i wybiórcze

7. Czynnik zestalający – agar, żelatyna

METODY OZNACZANIA LICZBY DROBNOUSTROJÓW

Bezpośrednie (oznaczanie sumy żywych i martwych komórek)

• Liczenie komórek w polu widzenia mikroskopu (zawiesina bakterii)

• Liczenie w komorze Thoma (grzyby)

Pośrednie (żywe komórki)

• Posiew ilościowy metodą płytkową Kocha – rozcieńczenia

• Płytka lana

• Posiew samoczynny z powietrza (metoda sedymentacyjna)

• Metoda filtrów membranowych

• Porównanie z wzorcami McFarlnda (metoda nefelometryczno-chemiczna)

• Rozpraszanie światła (spektrofotometr i densytometr)

1. Rodzaje podłóż bakteriologicznych.

• Skład chemiczny: naturalne, syntetyczne i półsyntetyczne; agarowe proste i złożone/ wzbogacone

• Cel hodowli: namnażające (SS), diagnostyczne, wybiórcze, różnicujące, transportujące, specjalne,

• Konsystencja: płynne, półpłynne, stałe

• Podłoże gotowe do użycia: dobra wartość odżywcza, pH, izotoniczne, przejrzyste, jałowe.

PROCES PRZYGOTOWANIA POŻYWKI MIKROBIOLOGICZNEJ

1. Przygotowanie jałowego szkła (mycie, sterylizacja, przechowywanie)

2. Przygotowanie podłoża (odważka pożywki zawieszona w wodzie destylowanej, ogrzewanie do uzyskania klarowności, korekcją pH, sterylizacja podłoża, studzenie, ponowna korekcja pH, dodanie składników termo labilnych – witaminy, sterylne rozlewanie do naczyń szklanych).

3. Przechowywanie podłóż – chłodnia.

1. Metody hodowli wirusów.

2. Metody hodowli grzybów.

3. Uzyskiwanie czystych kultur bakterii.

• Metody bezpośrednie

(mikromanipulator) - pod kontrolą wzroku

• Metody pośrednie

(posiew redukcyjny Kocha, płytka mazana, płytka lana, metoda seryjnych rozcieńczeń Listera)

• Metody pomocnicze

(selekcyjny wpływ temperatury, antybiotyków, podłoża – U-rurka)