Genetyka molekularna wyklad 11 , 16.05.2013

Genomika porownawcza: to dzial genomiki poszukujący podobieństw i roznic miedzy genomnami roznych gatunkoiw, o umozliwia: wyjaśnienie zaleznosci ewolucyjnych, rozbudowę wiedzy o genomie jednego gatunku w oparciu oi wiedze na temat genomu drugiego gatunku

Technika porownawcza malowania chromosomow: jej istotą jest wykorzystanie sond specyficznych dla konkretnego chromosomu (tzw sond malujących) jednego gatunku w porocedurze fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ na preparatach cytogenetycznych pochiodzacych oid innego gatunku

Porownawcze malowanie chromosomow umozliwia identyfikację konserwatywnych fragmentow chromosomow w genomach roznych gatunkow.

Porownawcze malowanie chromosomow pozwala na :

- identyfikację rearanzacji chromosomowych, które zaszły w trakcie ewolucji genomów

-przewidywanie, jakie geny znajdują się we fragmnentach chromosomowych badanego gatunku, które są „pomalowane” sondą chromosomu, którego sekwencja nukelotydowa i mapa genowa jest poznana

Technika porównawczego malowania chromosomow ma jednak pewne ograniczenia:

- jej rozdzielczość jest na poziomie kilku milionow par zasad

- nie wykrywa rearanzacji wewnatrzchromosomowych (inwersje, duplikacje)

Sonda molekularna – sklonowany lub zamplifikowany fragment DNA zawierający poszukiwana sekwencję np.:

- gen lub jego fragment

- anonimowy fragment genomu zawierający marker genetyczny

-zbior unikatowych sekwencji dla danego chromosomu lub jego fragmentu

Rodzaje sond molekularnych: sondy locus- specyficzne, centromerowe, telomerowe, „malujące”

Pochodzenie sond molekularnych

Sondy locus specyficzne: sondy pochodzące z klonowania molekularnego w wektorach: plazmidowych, kosmidowych,sztucznych chromosomach bakteryjnych (rozna wielkość sond od 2 kpz do 500 kpz), sondy wyprodukowane techniką amplifikacji PCR

Sondy specyficzne dla chromosomow bądź ich fragmentow utworzone na bazie DNA reperezntujacego konkretny chromosom : sortowanie chreomosomow w cytometrze przeplkywowym, mikrodysekcja chromosomow

Sortowanie chromosomów:

-pozyskanie jednorodnej frakcji zawierającej jeden chromosom z zawiesiny pchodzacej z hodowli in vitro

-wykorzystanie cytometru przepływowego(pozwala on na obserwowanie pojedynczych małych obiektów, np. komorek czy chromosomow, znakuje się go fluorescencyjnie, po intensywnoasci swiecenia wiemy czy obiekt jest duzy czy mały, dodatkowo rozne pary zasad mają różny profil swiecenia) zintegrowanego z sorterem

- amplifikacja sekwencji unikalnych dla danego chromosomu PCR- przygotowanie sondy

Kariotyp „przepływowy” : określenie profilu DNA danego chromosomu pod względem:

- ilości DNA ( długości cząsteczki)- wielkość chromosomu

- udział par AT i GC

Mikrodysekcja chromosomów : pozyskanie chromosomu lub jego fragmentu za pomocą mikromanipulatora lub lasera z preparatu mikroskopowoego, amplifikacja sekwencji unikalnych- przygorowanie sondy

Porownawcze mapy genomowe budowane sa roznwiez poprzez analizę rozmieszczenia maerkerów genetycznych

Porownawcze mapowanie genomow gatunkow z rodziny psowatych

Sobdy locus specyficzne wyprowadzone z genomu psa wykorzystywane do konstruowania map genomowych innych gatunkow psowatych

Technika porownawcza mapowania sond pozwala na badanie ewolucji kariotypow

Lokazlkizacja fizyczna loci markerowych w genomach badanych gatunkow umozliwia identyfikację wewnatrzchromosomowych rearazacji np. inwersji

Technika porównawczej hybrydyzacji genomowej: wykorzystywana do identyfikacji regionów chromosomów, w których nastąpoiła utrata (delecja) bądź amplifikacja genomowego DNA w komorkach nowotworowych. Hybrydyzuje się całe genomowe DNA komorek nowotworowych oraz komorek zdrowych. Sondy sa znakowane roznymi kolorami. Możemy wykrywac miejsca, gdzie doszło do duplikacji aalbo delecji.

Analiza porownawcza genomow na poziomie sekwencji nukleotydowych: poszczególne sekwencje sa porównywane za pomocą algorytmów FASTA lub BLAST w celu znalezienia charakterystycznytch regionów- motywów lub domen oraz rozpoznania sekwencji homologicznych (wywodzących się od wspólnego przodka)- tzw sekwencje ortologiczne

Analiza sekwencji nukleotydowych:

- umozliwia przeniesienie przypisanejh funkcji lub innych informacji z jednej sekwencji na inną na bazie ich podobieństwa

- porównanie sekwencji z wielu genomow ulatwia wyznaczanie granic genu i okreselenie jego struktury (eksony i introny)

- umozliwia zidentyfikowanie nienznanych regionow regulatorowych, motywów i domen w sekwencjach

Analiza porownawcza genomow na poziomie sekwencji aminokwasow: ulatwiaja klasyfikowanie bialeki i ich struktur w rozne grupy – rodziny, nadrodziny, ortologi, paralogi

Genomy sa bardzo polimorficzne: wykorzystanie w analizie genetycznej (sekwencje mikrosatelitarne, markery SNP), niektóre polimorfizmy mogą mieć znaczenie funkcjonalne

Identyfikacja milionow miejsc polimorficznych SNP umożliwiła stworzenie nowego narzędzia badawczego – mikromacierze SNP