1. Przebieg doświadczenia

W 100 ml buforze fosforanowym o stężeniu 0,1 M i pH=7 został sporządzone 10 ml roztworu GOD.

Stężenie GOD zostało tak dobrane, aby sbsorbancja przy długości fali 450 nm nie przekraczała 0.1 .

Następnie umieściliśmy roztwór GOD w kuwecie spektrofluorometrycznej, którą odpowietrzamy. Tak przygotowaną próbkę umieściliśmy w aparaturze do pomiaru zależności emisji od temperatury.

Wybraliśmy długość fali wzbudzającej na 450 nm oraz analizującej na 525 nm i uruchomiliśmy przyrząd, który rozpoczął rejestrację danych.

Po osiągnięciu temperatury odpowiadającej wskazaniu termopary równemu 3,8 mV zatrzymaliśmy pomiar.

1. Opracowanie wyników

   1. Dokonuję konwersji wartości napięcia rejestrowanego przez termoparę miedź-konstantan na temperaturę w skali kalwina

Korzystając z poniżej przedstawionego wykresu zależności temperatury (^oC) od napięcia (mV) wraz z naniesioną na nim prostą, wykorzystuje jej równanie aby przekonwertować uzyskane wyniki napięcia na temperaturę.

Wykres 1. Zależność temperatury od napięcia

Przykład obliczenia:

y = 24,03x gdzie x to jeden z otrzymanych przez nas wyników napięcia w mV ; y to temperatura w ^OC

dla x=3,5 mV y = 24,03 * 3,5 =84,16 ⁰C T_kelwina= 273,1 + T_celsjusza

84,16 ⁰C + 273,1 = 357,26 K

Tabela 1. Zestawienie wyników napięcia wraz z przeliczonymi wartościami temperatury

Napięcie (mV)	Temperatura (K)
2,12	323,99
2,20	325,94
2,29	328,13
2,37	330,03
2,45	331,94
2,41	331,07
2,32	328,84
2,29	328,24
2,32	328,97
2,38	330,36
2,45	332,03
2,52	333,66
2,59	335,39
2,68	337,43
2,77	339,67
2,88	342,25
2,97	344,36
3,07	346,78
3,19	349,70
3,31	352,66
3,50	357,26

2.2 Przekształcam uzyskane wyniki intensywności emisji na stopień przemiany zgodnie z równaniem:

$$\alpha = \frac{F\left( T \right) - F_{0}}{F_{\text{ko}n\text{cowa}} - F_{0}}$$

F­­₀ - początkowa wartość intensywności emisji (mV)

F(T) - intensywność emisji w temperaturze T (mV)

F_końcowa - końcowa wartość intensywności emisji (mV)

Przykład obliczenia :

$$\alpha = \frac{(7,4 - 2,2)mV}{(23,8 - 2,2)mV} = 0,24$$

Tabela 2. Zestawienie wyników intensywności napięcia wraz z przeliczonymi wartościami stopni przemiany

Intensywność emisji (mV)	Stopień przemiany
2,21	0,0000
2,16	-0,0023
2,25	0,0019
2,42	0,0096
2,60	0,0180
2,08	-0,0063
2,41	0,0090
2,35	0,0065
2,33	0,0057
2,91	0,0324
3,83	0,0752
5,16	0,1366
7,40	0,2407
10,34	0,3769
14,29	0,5601
18,86	0,7720
24,18	1,0189
25,50	1,0797
26,29	1,1166
25,35	1,0731
23,78	1,0000

2.3 Graficzne przedstawienie zależności α = f(T) oraz jej pierwszej pochodnej

Wykres 2. Zależność stopnia przemiany od temperatury

Wykres 3. Przedstawienie na wykresie pierwszej pochodnej α = f(T)

2.4. Wnioski

Celem ćwiczenia było wyznaczenia temperatury denaturacji oksydazy glukozowej.

Wykorzystujemy tu fakt, że wszelkie zmiany prowadzące do rozfałdowania struktury GOD są rejestrowane poprzez pomiar fluorescencji FAD.

Dzięki sporządzonemu wykresowi pierwszej pochodnej α = f(T) możemy z łatwością odczytać temperaturę denaturacji GOD wyznaczoną przez wyraźny ‘peak’ i wynosi ona 70­⁰C.