Nr. ćwiczenia: 9,10	Magdalena Firek	Nr. grupy: 7
Data wykonania ćwiczenia: 22.05.2013	Temat ćwiczenia: Fermentacja alkoholowa. Wpływ temperatury na natężenie oddychania. Wyznaczanie współczynnika oddechowego (RQ). Działanie inhibitora w cyklu Krebsa.	Zaliczenie:
Data oddania sprawozdania: 29.05.2013

Definicje:

Współczynnik oddechowy RQ mówi o rodzaju i charakterze substratu, wyznacza się go jako stosunek ilości wydzielonego CO₂ do ilości pobranego O₂, a jego przykładowe wartości to:

dla substancji zredukowanych:

• białek: 0,8,

• tłuszczy: 0,7,

• dla kwasów organicznych: >1, np. dla kwasu szczawiowego = 4,

• dla sukulentów: <1.

Efekt Pasteura mówi o tym, że wydajność glikolizy jest większa w warunkach beztlenowych, ponieważ w warunkach tlenowych może być hamowana przez nadmiar ATP.

Współczynnik Pasteura PQ to stosunek ilości glukozy zużytej w glikolizie w warunkach beztlenowych do ilości glukozy zużytej w glikolizie w warunkach tlenowych i przyjmuje wartości 2-6.

Kwas malonowy jest inhibitorem w cyklu Krebsa, jest strukturalnie bardzo podobny do kwasu bursztynowego, dzięki czemu hamuje aktywność dehydrogenazy bursztynianowej przez współzawodnictwo.

Ćwiczenie 2 z ćwiczeń 9

Oznaczanie natężenia fermentacji alkoholowej.

Po okresie tygodniowej inkubacji zdjęto filtry z CaCl₂ z kolbek z ćwiczenia numer 1 i ostrożnie wymieszano zawartość kolbek, uważając, aby kwas siarkowy nie wylał się z rurek. Zważono poszczególne kolbki z rurkami fermentacyjnymi z H₂SO₄ (ale bez CaCl₂). Po zważeniu kolbek z pożywką zawartość każdej kolbki oddzielnie odsączono do czystej kolbki przez sączek z bibuły, zmierzono za pomocą refraktometru stężenie cukru w przesączu.

Wyniki:

Rodzaj kolbki	Stężenie cukru [%]	Waga kolbki [g]	Ubytek CO2 w g (a)	C2H5OH w 100ml płynu w g (d)
	Przed inkubacją (c1)	Po inkubacji (c2)	Przed inkubacją (a1)	Po inkubacji (a2)
A1	10,5	3,5	125,28	122,71
A2	10	3,5	144,18	141,67
B1	23,5	10	126,60	122,18
B2	23,5	10	121,63	116,89

A₁ – b= 7; 6%b= 0,42; c= 6,58

A₂ – b= 6,5; 6%b= 0,39; c= 6,11

B₁ – b= 13,5; 6%b= 0,81; c=12,69

B₂ –b= 13,5; 6%b= 0,81; c= 12,69,

Przy czym b- ilość cukru zużytego przez drożdże (c₁-c₂); c- ilość cukru przefermentowanego (b-6%b).

Dla A₁:

1mol C₁₂H₂₂O₁₁ = 342g - 4mole C₂H₅OH = 184g

6,58g - d

d= 3,54g

Obliczenia dla pozostałych kolbek przeprowadzono analogicznie.

Ćwiczenie 3 z ćwiczeń 9

Próba jodoformowa (wykrywania alkoholu metodą Liebena).

Na przesączu pozostałym z ćwiczenia 2 przeprowadzono próbę jodoformową, którą stosuje się do wykrywania alkoholu. Do probówki dodano kilka ml przesączu i wrzucono kilka kryształków jodu oraz dodano kilka kropel 20% KOH, a następnie podgrzewano. Przeprowadzono obserwację pod mikroskopem.

Wyniki, wnioski:

Podczas podgrzewania można było poczuć charakterystyczny zapach jodoformu. Przy obserwacji pod mikroskopem można było zaobserwować sześcioramienne kryształki mrówczanu potasu, co sugeruje, że następujące reakcje miały przebieg:

CH₃CH₂OH + I₂ 2HI + CH₃CHO,

CH₃CHO + 3I₂ 3HI + Cl₃CHO,

Cl₃CHO + KOH HCOOK + CHI₃.

Ćwiczenie 4 z ćwiczeń 9

Identyfikacja gazowego produktu fermentacji.

Przygotowano 100ml 10% zawiesiny drożdży w 10% sacharozie. Roztworem napełniono kolbę fermentacyjną Eichmana i pozostawiono na pewien okres czasu aż zbierze się odpowiednia ilość gazu w rurze kolby. Następnie dodano kilka ml stężonego KOH, przykryto kciukiem otwór kolby i zmieszano ług z roztworem.

Wyniki, wnioski:

Doświadczenie to miało na celu zaobserwowanie zmianę objętości gazu. Podczas mieszania zawartości kolby doszło do wytworzenia podciśnienia, które skutkowało „zassaniem” palca. Jest to dowodem na to, że CO₂ zostało związane przez KOH.

Ćwiczenie 1 z ćwiczeń 10

Wyznaczanie współczynnika oddechowego (RQ) kiełkujących nasion.

Odważono osiem porcji po 1g kiełkujących nasion i umieszczono w naczyńkach 2-7. Brzegi szyjki w naczyńkach 1-4 posmarowano wazeliną celem zabezpieczenia przez wypływaniem roztworu KOH. Do studzienek w naczyńkach 1-4 nalano po 0,5ml 20% roztworu KOH, a do naczyniek 5-7 po 0,5ml wody destylowanej. Do studzienek włożono paski bibuły filtracyjnej. Połączono naczyńka z manometrami i umieszczono w kąpieli wodnej o temperaturze 25^oC. Włączono mechanizm wstrząsający aparatu i pozostawiono na 15-20 minut celem wyrównania temperatury w naczyńkach reakcyjnych. Po upływie tego czasu doprowadzono poziom płynu Brodiego w zamkniętym ramieniu manometru do wartości 150mm, zamknięto górne zawory i odczytano wysokości słupa cieczy w otwartym ramieniu manometru. Po 20 minutach ponownie odczytano poziom cieczy w manometrach i zapisano w tabelach.

Wyniki:

Naczyńka z KOH

Czas (min)	Nr manometru	Stała manometryczna (ko2)	Zmiany poziomu płynu Brodiego (w mm) w stosunku do odczytu poprzedniego	Pobrane μl O2 Xo2 (zmiana rzeczywista = h-x) x- zmiana w termobarometrze
			Odczyt manometru (mm)	Zmiana od odczytu początkowego ho2
1	2	3	4	5
0 20	1	0,98	147	137
0 20	2	1	150	37
0 20	3	1,01	151	46
0 20	4	0,99	151	15

Naczyńka bez KOH

Czas (min)	Nr manometru	Stała manometryczna (ko2)	Zmiany poziomu płynu Brodiego (w mm) w stosunku do odczytu poprzedniego	Wydzielone μl CO2 Xco2 = (h- Xo2)
			Odczyt manometru (mm)	Zmiana od odczytu początkowego hco2
1	2	3	4	5
0 20	5	0,98	150	114
0 20	6	1,02	151	115
0 20	7	1,00	153	111

RQ= CO₂/O₂= 80,9/109,1= 0,74

Wnioski:

Współczynnik RQ wyniósł ok. 0,7 czyli odpowiednio dla tłuszczy. Badanie przeprowadzono na kiełkujących nasionach. Jak wiadomo tłuszcze występują w nasionach więc wynik ten jest prawidłowy.

Ćwiczenie 2 z ćwiczeń 10

Działanie inhibitora w cyklu Krebsa- hamowanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej przez współzawodnictwo.

Przygotowano 4 probówki i oznaczono je: A, B, C, D. Sporządzono następujące roztwory:

• 4ml wody, 2ml 25% zawiesiny drożdży,

• B-2ml 1M glukozy, 2ml 1M kwasu bursztynowego, 2ml 25% zawiesiny drożdży,

• 1ml 1M glukozy, 2ml 1M kwasu malonowego, 2ml 25% zawiesiny drożdży,

• 2ml 1M glukozy, 2ml 25% zawiesiny drożdży, 1ml 1M kwasu bursztynowego, 1ml 1M kwasy malonowego.

Do każdej probówki dodano po 100μl błękitu metylenowego w celu uzyskania ciemnoniebieskiej barwy roztworu i całość dokładnie wymieszano. Trzymając probówkę pod małym kątem dodano do wysokości około 1 cm oleju mineralnego, celem utworzenia błonki zapobiegającej dostępowi tlenu z zewnątrz. Probówki umieszczono w termostacie w temperaturze 37^oC. Po około 20 minutach przeprowadzono obserwację.

Wyniki:

Probówka	Barwa początkowa	Barwa końcowa
A	ciemnoniebieska	jasnoniebieska
B		morska
C		turkusowa
D		jasnoniebieska (ciemniejsza niż A)

Wnioski:

W probówce A roztwór był ciemniejszy niż barwa roztworu początkowego, mogło być to spowodowane mieszaniem roztworu i dostaniem się do środka powietrza co przyspieszyło reakcję. W probówce B roztwór miał kolor jaśniejszy ponieważ znajdował się tak kwas bursztynowy, który po przekształceniu w kwas fumarowy spowodował redukcję indykatora dehydrogenacji co doprowadziło do odbarwienia wskaźnika (błękit metylenowy). W probówce C doszło do utlenienia błękitu metylowego ponieważ znajdował się tak kwas Malanowy który jest inhibitorem dehydrogenazy . W D kolor najmniej odbiegał barwa od próby ponieważ ilość akceptora elektronowego była podobna.