Sprawozdanie z zajęć ćwiczeniowych z agrobiotechnologii

Temat ćwiczeń:

Analiza restrykcyjna bakteriofaga λ

Cel ćwiczeń:

Strawienie DNA bakteriofaga λ oraz analiza wyników w oparciu o mapy restrykcyjne badanych enzymów.

Zasada metody:

Pierwszym krokiem w analizie sekwencji sklonowanego odcinka DNA jest ustalenie, jak uszeregowane są na nim miejsca cięcia enzymami restrykcyjnymi. Enzymy restrykcyjne przecinają duże cząsteczki DNA, dając powtarzalne zbiory stosunkowo niewielkich fragmentów DNA. Fragmenty te można rozdzielić ze względu na ich wielkość dzięki elektroforezie w półpłynnym żelu. Ogólnie rzecz biorąc, im krótszy jest taki dwuniciowy odcinek, tym szybciej porusza się on w polu elektrycznym. Stosując różne rodzaje elektroforezy, można rozdzielać fragmenty liczące od dwudziestu do milionów par zasad. Używając wzorców, czyli odcinków o znanej wielkości, można łatwo określić wielkość badanego fragmentu. Do przeprowadzenia analizy wystarcza zwykle mniej niż mikrogram (milionowa część grama) DNA, ponieważ odcinki DNA można łatwo wykryć po wybarwieniu ich odpowiednim barwnikiem. Zestaw fragmentów powstających w wyniku działania określonej restryktazy stanowi swoisty „odcisk palca” wyjściowego DNA. Analizując fragmenty powstałe w wyniku działania różnych enzymów restrykcyjnych oraz ich rozmaitych kombinacji, można często ustalić kolejność występowania badanych fragmentów w wyjściowej cząsteczce DNA. W rezultacie otrzymujemy fizyczną mapę DNA, która, jeśli jest wystarczająco szczegółowa, jednoznacznie opisuje oryginalną cząsteczkę DNA. Zrekombinowane wektory są zwykle niewielkie, skonstruowanie ich mapy fizycznej nie przedstawia więc dużych trudności. Jednak trawienie enzymami restrykcyjnymi dużych cząsteczek DNA daje złożone zestawy fragmentów.

Enzymy restrykcyjne - enzymy z grupy endonukleaz przecinające nić DNA w miejscu wyznaczanym przez specyficzną sekwencję DNA. Rozpoznawana sekwencja z reguły ma charakter symetryczny o długości od 4 do 8 par zasad (pz), choć zdarzają się częste wyjątki. Restryktazy wraz z metylazami DNA stanowią system restrykcji i modyfikacji DNA, który w organizmach prokariotycznych stanowi mechanizm odpornościowy zapobiegający infekcjom przez bakteriofagi.

Podział enzymów restrykcyjnych:

Typy enzymów:

• Typ I - wielopodjednostkowe kompleksy enzymatyczne zawierające aktywności metylazy i restryktazy. Przecinają DNA z dala od rozpoznawanej sekwencji, w bliżej nieokreślonym miejscu. Z tego powodu nie mają większego zastosowania praktycznego.

• Typ II - przecinają DNA w zdefiniowanym miejscu, w obszarze rozpoznawanej sekwencji lub w jej pobliżu. Składają się z pojedynczych polipeptydów. Rozpoznają sekwencje symetryczne.

• Typ IIs - zbliżone do typu II, przecinają z jednej strony rozpoznawanej sekwencji, która jest asymetryczna.

• Typ III - duże kompleksy, które wymagają dwóch sekwencji rozpoznawanych w pobliżu siebie. Bez znaczenia praktycznego.

• Typ IV - zbliżone do typu II. Zawierają aktywność metylazy i restryktazy w tym samym polipeptydzie. Przecinają DNA w zdefiniowanym obszarze poza sekwencją rozpoznawania. Aktywności metylazy i restryktazy nie mogą działać równocześnie. Enzym "przełącza" się w zależności od substratu.

Podział według rodzaju wytwarzanych końców:

• tępe końce - nici rozcięte naprzeciwko siebie - wszystkie nukleotydy są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnym łańcuchu

• lepkie końce - 3` lub 5` ssDNA (jednoniciowe) ogony na obu końcach utworzone przez niesymetryczne cięcie , komplementarne do podobnych tworzonych w innych cząsteczkach DNA przez te same enzymy restrykcyjne niezależnie od źródła DNA , co pozwala na ligowanie DNA nawet bardzo różniących się gatunków czyli formowanie chimerycznych molekuł.

Podział według sekwencji rozpoznawanej:

• czwórkowe - rozpoznają sekwencję DNA złożoną z czterech nukleotydów. Statystycznie w dowolnym DNA takich miejsc jest dużo - co 256 bp. Restryktazy takie mogą strawić DNA na bardzo małe kawałki.

• szóstkowe - rozpoznają sekwencję DNA złożoną z sześciu nukleotydów. Dowolne miejsce restrykcyjne złożone z sześciu nukleotydów występuje statystycznie co około 4096 bp w DNA , w którym ilości poszczególnych nukleotydów są równe. Proporcje te zmieniają się w zależności od organizmu , dlatego dobór enzymu szóstkowego i warunki należy ustalić eksperymentalnie.

• ósemkowe - stosowane niezbyt często. Tną DNA bardzo rzadko.

Nomenklatury enzymów użytych podczas ćwiczeń:

• BamH I - pierwszy enzym wyizolowany z Bacillus amyloliquefaciens szczepu H

• EcoRI - pierwszy enzym wyizolowany z Escherichia coli szczepu R

• Hind III - trzeci enzym wyizolowany z Haemophilus influenzae szczepu d

• Sal I - pierwszy enzym wyizolowany z Streptomyces albus

• Bgl II - drugi enzym wyizolowany z Bacillus globigii

Enzym	Rozpoznawana sekwencja	Cięcie
EcoRI	5'GAATTC	5'---G AATTC---3'
	3'CTTAAG	3'---CTTAA G---5'
BamH I	5'GGATCC	5'---G GATCC---3'
	3'CCTAGG	3'---CCTAG G---5'
Hind III	5'AAGCTT	5'---A AGCTT---3'
	3'TTCGAA	3'---TTCGA A---5'
Sal I	5'GTCGAC	5'---G TCGAC---3'
	3'CAGCTG	3'---CAGCT G---5'
Bgl II	5'AGATCT	5'---A GATCT---3'
	3'TCTAGA	3'---TCTAG A---5'

Wyniki:

W 1 studzience zastosowaliśmy marker 1kb DNA. Jest jednym z najpopularniejszych markerów, pozwalających określić wielkość dwuniciowego DNA o masie od 250 do 10000 bp. Fragmenty wielkości 1000 i 3000 bp na żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny są widoczne z relatywnie większą intensywnością w porównaniu do innych prążków i służą jako punkt odniesienia.

Wnioski:

Analiza długości fragmentów restrykcyjnych jest metodą inżynierii genetycznej wykorzystującą polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP). W metodzie tej wykorzystuje się trawienie DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych i elektroforezę. Już zmiana pojedynczego nukleotydu w sekwencji rozpoznawanej przez enzym spowoduje, że nie dokona on rozcięcia DNA, co powoduje, że np. w dwóch różnych próbkach powstanie różna ilość fragmentów DNA, będących produktami rozkładu pierwotnej cząsteczki. Fragmenty te będą się także różnić wielkością. Elektroforeza umożliwi rozróżnienie wielkości tych fragmentów, co będzie widoczne jako różnica w ilości i położeniu poszczególnych prążków na elektroforogramie.

W naszym doświadczeniu można odczytać następujące długości prążków na 5 zdjęciach powstałe w wyniku cięcia enzymami restrykcyjnymi:

Enzym BglII - 700

2600

8000

12000

BamH I -7000

9000

12000

EcoR I - 4500

5500

6500

9000

13000

Hind III - 2100

2400

7000

8000

11000

13000

Sal I - 2000

11000

Uzyskane wyniki można porównać z wirtualnym strawieniem DNA bakteriofaga lambda:

Bgl II

#	Ends	Coordinates	Length (bp)
1	BglII-BglII	416-22425	22010
2	BglII-BglII	22426-35711	13286
3	BglII-(RightEnd)	38815-48502	9688
4	BglII-BglII	35712-38103	2392
5	BglII-BglII	38104-38754	651
6	(LeftEnd)-BglII	1-415	415
7	BglII-BglII	38755-38814	60

BamHI

 

#	Ends	Coordinates	Length (bp)
1	BamHI-BamHI	5506-22346	16841
2	BamHI-BamHI	34500-41732	7233
3	BamHI-(RightEnd)	41733-48502	6770
4	BamHI-BamHI	27973-34499	6527
5	BamHI-BamHI	22347-27972	5626
6	(LeftEnd)-BamHI	1-5505	5505

EcoRI

#	Ends	Coordinates	Length (bp)
1	(LeftEnd)-EcoRI	1-21226	21226
2	EcoRI-EcoRI	31748-39168	7421
3	EcoRI-EcoRI	39169-44972	5804
4	EcoRI-EcoRI	26105-31747	5643
5	EcoRI-EcoRI	21227-26104	4878
6	EcoRI-(RightEnd)	44973-48502	3530

 

HindIII

#	Ends	Coordinates	Length (bp)
1	(LeftEnd)-HindIII	1-23130	23130
2	HindIII-HindIII	27480-36895	9416
3	HindIII-HindIII	37460-44141	6682
4	HindIII-(RightEnd)	44142-48502	4361
5	HindIII-HindIII	25158-27479	2322
6	HindIII-HindIII	23131-25157	2027
7	HindIII-HindIII	36896-37459	5

 

SalI

#	Ends	Coordinates	Length (bp)
1	(LeftEnd)-SalI	1-32745	32745
2	SalI-(RightEnd)	33245-48502	15258
3	SalI-SalI	32746-33244	49

 

Sal I

EcoR I

Hind III

10000

8000

6000

5000

4000

3500

3000

2500

2000

1500

250

500

750

1000

BamH I

Marker

Bgl II

---