Barwienie w cytodiagnostyce

Papanicolau- powszechnie przyjęta metoda barwienia preparatów do cytodiagnostyki

HE- barwienie ogranicza wartości diagnostyczne preparatów cytologicznych, dlatego powinno być zaniechane

Barwienia specjalne oraz immunocytochemia- stosunkowo rzadko wykorzystywane w cytologii ginekologicznej

1. barwienie papanicolau(pap)-

• 7 modyfikacji- wybiera się tą która pasuje osobie oceniającej preparat

• intensywność wyzna kowania jądra i cytoplazmy mogą być różne

• podstawowe barwienie w cytologii

• 3 barwniki:

a. hematoksylina harrisa

b. oranż G, OG-6

c .EA(kilka barwników)

Efekty wybarwienia:

• jądro komórkowe- niebieskie, stukturze ......, dobrze zachowane szczegóły budowy(„zgniecione”)

• cytoplazma- szerokie spektrum kolorów co umożliwia odróżnienie komórek aktywnych metabolicznie(kolor niebiesko- zielony) od nieaktywnych(kolor różowy

• Hematoksylina(zasadowa)

• barwi związki o charakterze kwasowym

• proszek- (zredukowana forma)




+jodek sodu/tlenek rtęci(utlenianie)

hemateina

+ ałun potasu/amonowy- wywołuje powstanie typowego ciemnoniebieskiego lub purpurowego zabarwienia hematoksyliny

w pH zasadowym hemateina barwi strukturę komórki na kolor niebieski

w pH kwaśnym na purpurowo

3. Podział barwień:

• barwienie progresywne- barwimy komórki do zabarwienia, które jest pożądane, hematoksylina z kwasem octowym

• barwienie regresywne-przebarwiamy komórkę, a następnie usuwamy odbarwiaczem, w barwieniu Papanicolau nadmiar hematoksyliny jest usuwany kwasem solnym, hemtoksylina bez kwasu octowego

• kwaśne środowisko uzyskane przez dodatek kwasu octowego(kw.cytrynowego)do hematoksyliny wzmacnia znakowanie jądra poprzez stabilizację kompleksu ałun- hemateina

• Rodzaje hematoksyliny:

hematoksylina Harrisa

• utlenienie hematoksyliny do hemateiny zachodzi dzieki działaniu tlenku rtęci

• najczęściej używana do barwienia regresywnego(niektórzy stosuja także do barwienia progresywnego)

• ałun potasowy lub amonowy

• kwas octowy- tylko do barwienia progresywnego

• nadmiar barwnika w barwienie regresywnym jest usuwany za pomoca kwasu solnego(0,25%), nastepnie kwas jest wypłukiwany za pomocą wody bieżącej

Hematoksylina Meyera

• utlenianie hematoksyliny do hemateiny zachodzi dzieki dzialaniu jodku sodu

• głównie do barwienia preparatów histologicznych(bar. Progresywne)

• substancje odpowiedzialne za indukcje koloru w barwieniu jest ałun amonowy

hematoksylina Gilla

• tylko i wyłacznie do barwienia w automatach(do barwienia progresywnego, ponieważz w automatach się nie odbarwia)

• Jądro komórkowe po barwieniu regresywnym:

• jednolite i ciemniejsze

• intensywniej zaznaczone rejony jądrowej hiperchromatazji

• chromatyna doskonale uwidoczniona

• wyraźny kontrast pomiędzy jądrem a cytoplazmą

• Bluing agents(odbariacze)

• wpływ na zabarwienie jądra komórkowego

• pozwala na usunięcie tła spowodowanego przez działanie hematoksyliny

• sprawiają , że szczegóły budowy j. kom są znacznie lepiej widoczne

• wzmacnia się przezroczystość cytoplazmy

Najczęściej używane bluing agents:

• węglan litu

• woda amoniakalna

• woda bieżąca o pH wyższym niż 8

• Barwienie cytoplazmy:

• oranż G

• barwnik kwaśny , barwienie keratyną na kolor pomarańczowy

• keratyna nie jest obecna w zdrowych komórkach plaskobłonkowym może być obecna w keratynizowanych komórkach raka

• określenie występowania „pomarańczowym” komórek jest zatem ważne w diagnostyce

• w wielu laboratoriach dodaje się kwas octowy do barwnika aby wzmocnić specyficzność barwnika i skrócić czas barwienia

• dodatek kw. Fosfowolframowego, który silnie wiąże się do białek pozwala na lepsze zachowanie koloru

• Barwnik EA

1. eozyna Y

2. zieleń świetlna SF

3. kwas fosfowolframowy(do wzmacniania koloru)

hematoksylina rozpuszczalna w wodzie

reszta barwników przygotowywana na bazie etanolu i nim także wypłukiwane.

ANALIZA ZABURZEŃ GENETYCZNYCH NA POZIOMIE BIAŁEK

Izolacja białka totalnego , elektroforeza, przecięcie białek na membranę , charakterystyka interesujących nas białek z użyciem przeciwciał(western blotting)

Wyjmujemy żel ze szklanych szybek




Struktura kanapka






bibuła

żel po elektroforezie







membrana celulozowa



na dole kilka warstw bibuły nasączone buforem







Białka wędrują w żelu i przenoszą się na membranę, żel pozbawiony białek usuwamy, zajmujemy się membraną.

Blokowanie membrany(tła- BSA albumina serum wołowego)




Przeciwciała I




Przeciwciało II(znakowane enzymem- alkaliczna fosfataza)




Substrat

Przygotowanie żelu-> polimeryzacja w żel-> nakładanie białka zabarwionego na niebiesko(żebyśmy wiedzieli kiedy skończy się elektroforeza)-> umieszczamy płytki w komorze elektroforetycznej{jednocześnie można zrobić 4 żele, przy czym jeden przeznaczany jest do barwienia}.

1.Barwienie wg Papanicolau:

1. woda włożyć preparaty

2. hematoksylina wg Harrisa 4 min

3. woda bieżąca płukać 3x

4. odbarwiacz

5. woda amoniakalna

6. woda bieżąca płukać długo

7. alkohol 96%- 2 min

8. OG-6 5min

9. alkohol 96% 1 min

10. EA-50 5 min

11. alkohol 96% 1 min

12. alkohol 96% 1 min

13. aceton płukać 3x

14. ksylen prześwietlić

15. zamknąć balsamem

2.Bufor do elektroforezy TBE

T- tris HCl nadaje pH buforowi, siła jonowa

B- kw. Borowy, umożliwia wędrówkę jonów w polu elektrycznym

E- EDTA wiąże jony dwuwartościowe głównie jony Mg2+ niezbędne dla działania nukleaz

Ostatecznie stężenie w żelu 1 raz

3.Bufor probówkowy:

dwa barwniki

• cyjanoksylen- barwnik, który wędruje tak samo szybko jak białka

• blekit bromofenolowy- barwnik, który wędruje szybciej niż białka, sygnał do ukończenia elektroforezy, gdy 1 cm od końca żelu

4. Składniki żelu poliakryloamidowego:

• bisakrylamid

• akrylamid

• w różnych proporcjach 19:1; 49:1; 29:1; 37,5:2(dla białek)

• od proporcji zależy porowatość żelu

• gliceryna- umożliwia nałożenie żelu do kieszeni

5. Katalizatory:

• nadsiarczan amonu(APS)- zawsze na świeżo

• TEMED

Literatura:

Słomski „Analizy DNA”

Genomy

---