54. Pęcherzyki opłaszczone klatryną - powstawanie i losy.

Generalnie, pęcherzyki opłaszczone klatryną kierowane są do endosomów z błony komórkowej (te właściwie to są wczesnymi endosomami) lub do lizosomów przez późne endosomy z trans-Golgiego.

Pęcherzyki te mają dwie warstwy płaszcza: wewnętrzną zbudowaną z białek AP lub GGA (różne warianty dla różnych pęcherzyków) i zewnętrzną zbudowaną z klatryny. Klatryna tworzy charakterystyczne jednostki zwane triskelionami, z których każdy ma trzy łańcuchy ciężkie (180kDa) i trzy lekkie (35-40kDa). Asoscjują one po 36 tworząc wielościan o ściśle określonym zakrzywieniu powierzchni i średnicy. W środku znajduje się pęcherzyk, a między nim a klatryną - kompleksy AP (340kDa), z których każdy skalda się z czterech rożnych podjednostek zwanych adaptynami. To właśnie one określają jakie białka (receptor i związane z nimi ligandy) wejdą do pęcherzyka, stąd ich nazwa - AP=adapter proteins (o specyficzności w następnym zagadnieniu). Pęcherzyki opłaszczone AP1 lub GGA powstają w trans-Golgim i kierują się do lizosomów przez późne endosomy. Te opłaszczone AP3 również powstają w trans-Golgim i kierują się bezpośrednio do lizosomów lub podobnych do lizosomów organelli spichrzowych. Oplaszczenie AP2 natomiast, powstają w błonie komórkowej i tworzą wczesne endosomy, które na skutek fuzji zmieniają się w późne endosomy i łączą z lizosomami.

Wszystkie pęcherzyki klatryna/AP tworzą się dzięki GTP-azie ARF, a do ich odpoączkowania konieczna jest jeszcze dynamina, o której szerzej w następnym zagadnieniu. Powtarzając to co już było i za chwile będzie, aktywna - związana GTP forma ARF wiąże się z błoną i rekrutuje kompleksy AP i klatrynę. AP rekrutują odpowiednie receptory/białka transportowe, a klatryna powoduje wybrzuszanie się błony i tworzenie pęcherzyka. W końcu, dynamina wykorzystuje energię z GTP aby odciąć pęcherzyk od błony donorowej. Etap z dynaminą odbywa się tylko dla pęcherzyków klatrynowych. Nie wiadomo, dlaczego inne mogą odpączkować bez dynaminy.

Zaraz po utworzeniu pęcherzyka jego płaszcz oddysocjowuje. Prawdopodobnie dzieje się to z wykorzystaniem energii z ATP przez cytozolowe białko Hsc70. Pozwala to nie tylko na recykling płaszcza, ale też odsłania miejsca wiązania Rab i białka SNARE.

Pęcherzyki klatryna/AP1 jeden mają jedną charakterystyczną cechą, mianowicie transportują rozpuszczalne enzymy lizosomalne do późnych endosomów. Enzymy te mają sekwencje sygnalne, które w odróżnieniu od większości sekwencji sygnalnych białek są resztami cukrowymi a nie krótkimi fragmentami polipeptydowymi. Ten fragment sygnalny to mannozo-6-fosforan, dodawany w cis-Golgim. Enzymy te przechodzą taką samą N-glikozylację w ER jak białka mające iść na zewnątrz komórki, ale w Golgim na końce ich łańcuchów cukrowy dodawana jest ufosforylowana mannoza. W trans-Golgim M6P rozpoznawany jest przez transbłonowe receptory, które z kolei rozpoznawane są przez AP1. W kwaśnym pH endosomu M6P dysocjuje,a fosfatazy odcinają resztę fosforanową. Receptory M6P podobnie jak inne receptory/białka transportowe odpączkowują w specjalnych pęcherzykach i wracają do trans-Golgiego, choć czasami mogą trafić do błony komórkowej, gdzie biorą udział w odzyskiwaniu na drodze endocytozy wydzielanych do środowiska enzymów lizosomalnych. Późne endosomy w końcu łączą się z lizosomami i enzymy trafiają na swoje miejsce.

55. Adaptyny, dynamina, ARF

Adaptyny to białka tworzące kompleksy AP oplaszczające pęcherzyki. Od ich specyficzności zależy to jakie receptory/białka transportowe znajdą się w pęcherzyku. Rozpoznają one krótkie cytozolowe fragmenty sortujące transmembranowych receptorów/białek transportowych.

Pęcherzyki idące z trans-Golgiego do lizosomów przez późne endosomy są opłaszczone AP1 lub GGA (różnice między tymi dwoma są na razie nieznane). Rozpoznają one sygnał sortujący YXXΦ (Y=Tyr, X=dowolny aa, Φ=duży hydrofobowy aa) w domenie cytozolowej receptorów i białek transportowych. Pęcherzyki opłaszczone AP3 idą do lizosomów z pominięciem późnych endosomów, jest to szczególnie ważne w komórkach w których występują podobne do lizosomów organella magazynowe np. w komórkach barwnikowych skóry albo w komórkach tworzących płytki krwi. Pęcherzyki oplaszczone AP2, również rozpoznające YXXΦ to pęcherzyki z błony komórkowej do późnych endosomów przez wczesny endosom.

ARF to GTP-aza biorąca udział przy tworzeniu pęcherzyków klatryna/AP. Jej dokładna rola i mechanizm działania zostały przedstawione w zagadnieniu 52.

Dynamina to GTP-aza konieczna do odcięcia nowo utworzonego pęcherzyka od błony donora. Występuje tylko przy pęcherzykach opłaszczonych klatryną/AP2. W końcowej fazie pączkowania, dynamina polimeryzuje tworząc pierścień dookoła „szyjki” pęcherzyka. Wydaje się obecnie, że używa ona energii z hydrolizy GTP do zaciśnięcia się i oderwania pęcherzyka. W przypadku jeśli zablokujemy dynaminę, w komórce zakumulują się wykształcone, ale nie oderwane pęcherzyki.

56. 
    Losy receptorów w endocytozie.

Przed związywaniem substratu receptory poruszają się swobodnie w błonie komórkowej, albo też związane są z dołkami klatrynowo/AP2. Związanie substratu powoduje zmianę konformacyjną kierująca te swobodne do dołków. Tam sekwencje sortujące w C-końcowych domenach cytozolowych, najczęściej jest to YXXΦ, rozpoznawane i wiązane są specyficznie przez adaptyny kompleksów AP2. Formuje się pęcherzyk, który po oddysocjowaniu płaszcza tworzy wczesny endosom, a następnie po fuzji z innymi pęcherzykami z błony i z Golgiego - późny endosom. Jak już było mówione, w późnym endosomi panuje niższe pH niż w cytozolu/Golgi/na zewnątrz, poniżej 6. Jest to skutek działania błonowych V ATP-az. W takim pH większość receptorów uwalnia swoje ligandy. Pod mikroskopem elektronowym późne endosomy wyglądają na sferyczne, ale z tubularnymi wypustkami. Okazało się, że w tych wypustkach gromadzą się wolne receptory, które następnie odpączkowują i ulegają recyklingowi, wracając do membrany. Dla przykładu receptor LDL, którego czas życia w komórce wynosi średnio 20h, odbywa jeden cykl błona->endosom->błona w 10-20 minut, czyli 60-120 razy w ciągu swego życia. Recykling receptorów pokazany był na obrazkach przy pęcherzykach klatrynowych i prze endocytozie. Poniżej zdjęcie recyklingu receptorów LDL.

57. Transport LDL.

Transport LDL to przykład endocytozy z udziałem receptorów. LDL to lipoproteina zawierająca na zewnątrz warstwę fosfolipidów i jedno duże białko apoB-100. W środku znajdują się estry cholesterolu, a całość ma 20-25nm średnicy. Receptor LDL, ekspersjonowany w większości ssaczych komórek to transmembranowa glikoproteina z krótkim cytozolowym C-końcem zawierającym sygnał sortujący NPXY - rozpoznawany przez AP2. N-koniec białka eksponowany na zewnątrz komórki zawiera domenę β-śruby (chyba tak to się nazywało, było na enzymologii na pewno, jak ktoś chce może sprawdzić^^) oraz bogatą w cysteinę domenę (7 powtórzeń motywów bogatych w cysteinę) wiążącą apoB-100. Po związaniu LDL receptor kierowany jest do formującego się pęcherzyka i razem z nim trafia do późnego lizosomu. Tam, pH niższe od 6 powoduje, że histydyny z domeny β-śruby zyskują ładunek dodatni i wiążą się z ujemnie naładowanymi resztami domeny wiążące ligand, wyrzucając ligand z kompleksu (uwielbiam takie motywy, gdzie białka działają jak takie mechaniczne urządzonka/silniczki^^). Receptor LDL wraca do błony, a składniki LDL są hydrolizowane przez enzymy lizosomalne.

58. 
    Transport żelaza do komórki.

Żelazo transportowane jest do komórki w kompleksie z transferryną na drodze endocytozy z udziałem receptorów. Jednak jest ona trochę inna niż większość procesów endocytozy, ale najpierw o transferrynie. Transferryna to jeden z głównych składników osocza. Jest glikoproteiną transportującą żelazo z jelita i wątroby do reszty ciała. Ma dwie formy: niezwiązaną z żelazem apotransferrynę, która bardzo mocno wiąże dwa jony Fe3+ dając ferrotransferrynę. Wszystkie ssacze komórki mają receptory ferrotransferyny wiążące ją w obojętnym pH i jest ona endocytowana przez pęcherzyki klatrynowo/AP2 jak inne substancje. Jednak kiedy pęcherzyki docierają do późnych lizosomów pojawiają się pewne różnice. W normalnym przypadku, jak np. LDL, cały ligand oddziela się od receptora i jest trawiony. W przypadku transferryny zmiana pH powoduje dysocjację tylko jonów Fe3+, które na nieznanej drodze są redukowane do jonów Fe2+ a następnie wydzielane z endosomu przez transporter jonów dwudodatnich. Po uwolnieniu jonów żelaza ferrotransferryna przechodziapotransferrynę, która w niskim pH świetnie wiąże receptor i wraz z nim do błony komórkowej. Tam, w neutralnym pH wiązanie między apotransferryną i receptorem słabnie i apotransferryna jest uwalniana do środowiska (czyli płynu okołokomórkowego a nast. Krwioobiegu).

Rysunek jest mój własny, proszę nie narzekać. Zielone to apotransferryna, pomarańczowe to ferrotransferyna, żółte to receptor. GÓRNA I DOLNA POŁOWA OBRAZKA OZNACZAJĄ RÓŻNE WARUNKI pH. NIE SĄ W ŻADNYM WYPADKU GRAFICZNĄ REPREZENTACJĄ PRZEDZIAŁÓW KOMÓRKOWYCH.

59. 
    Przykłady zjawisk transportu odbywającego się za pośrednictwem endocytozy z udziałem receptora.

Nie jestem pewien, czy w tym pytaniu należy też je opisać, czy tylko wymienić. Jeśli myślicie, że opisać, to opisy są powyżej a tu tylko wymienię:

• wchłanianie LDL przez komórki

• transport żelaza do komórki

• transport hormonów peptydowych do komórki np. insuliny

• wchłanianie niektórych glikoprotein

• odzyskiwanie wydzielonych enzymów lizosomalny przez receptory M6P błony komórkowej

---