Ćw. 9. Najnowsze metody diagnostyczne. Test ELISA. Aglutynacja bierna. Odczyny

lateksowe.

1. Aglutynacja bierna:



Stosowana częściej niż aglutynacja czynna



W odczynie aglutynacji biernej wykorzystuje się zdolnośd wielu rozpuszczalnych antygenów do
absorpcji na różnych nośnikach np.:

-

krwinkach czerwonych

(często stosowane ze względu na ich dostępnośd i zdolnośd

adsorbowania wielu antygenów)

-

cząsteczkach kolodium

-

cząsteczkach bentonitu

-

cząsteczkach lateksu



Antygeny mogą się adsorbowad na powierzchni krwinek

samoistnie

lub

po uprzedniej modyfikacji powierzchni

erytrocytów

różnymi związkami chemicznymi np.:

-

kwasem taninowym

-

chlorkiem chromowym

-

aldehydem glutarowym



Zdolnośd do samoistnego adsorbowania się na powierzchni
krwinek posiadają:

-

antygeny wielu bakterii

-

polisacharydy

-

antybiotyki

-

albuminy obcogatunkowe

-

DNA



Najczęściej używa się:

-

krwinek ludzkich grupy 0

-

krwinek barana

-

erytrocytów kooskich

 Opłaszczone antygenem erytrocyty zlepiają się w obecności swoistych przeciwciał, a w obecności

dopełniacza ulegają lizie



Wadą erytrocytów jako nośników antygenu jest:

-

niestabilnośd błon komórkowych

-

występowanie na ich powierzchni własnych antygenów (reagują z naturalnymi przeciwciałami,
obecnymi w obcogatunkowych surowicach normalnych i odpornościowych)



W celu zmniejszenia samoistnej lizy, krwinki można utrwalid formaliną i przechowywad w temperaturze
4°C przez kilka tygodni



W celu uniknięcia trudności związanych z występowaniem

przeciwciał heterofilnych

w surowicach

różnych zwierząt, badaną surowicę adsorbuje się wstępnie krwinkami nie opłaszczonymi



Odczyn hemaglutynacji biernej (OHB) jest jednym z najczulszych odczynów immunologicznych,
służacym do wykrywania przeciwciał w surowicach

-

np. pozwala na wykrycie 0,005 μg azotu przeciwciała w 1 ml

-

podczas gdy czułośd, np. odczynu wiązania dopełniacza jest 20-krotnie mniejsza

Wykorzystanie reakcji aglutynacji biernej w diagnostyce immunologicznej:



wykrywanie czynnika reumatoidalnego (RF) w surowicach chorych



wykrywanie przeciwciał przeciwtężcowych w surowicy krwi ludzkiej



wykrywanie przeciwciał przeciw mononukleozie zakaźnej



wykrywanie przeciwciał przeciw streptolizynie O

RF-Waaler – wykrywanie czynnika reumatoidalnego



wykrywanie czynnika reumatoidalnego w surowicy chorych



czynnik reumatoidalny (

Rheumatoid Factor - RF

) występujący w surowicy chorych na reumatoidalne

zapalenie stawów, jest autoprzeciwciałem skierowanym przeciwko domenom CH2 i CH3 fragmentu Fc
immunoglobulin klasy IgG



najczęściej RF występuje w klasie przeciwciał IgM (85%)



w wielu przypadkach RF może służyd za marker procesów autoimmunologicznych (często występuje w
toczniu rumieniowatym układowym czy zespole Sjögren’a)



RF występuje u 80 – 85 % pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (Rheumatoid Arthritis –
RA), a jego oznaczanie jest badaniem pomocniczym w diagnostyce RA



w praktyce czynnik ten jest oznaczany za pomocą testu lateksowego lub Waalera Rosego

-

w teście lateksowym używa się opłaszczonych γ-globuliną ludzką kuleczek lateksu, które pod
wpływem RF ulegają aglutynacji

-

w metodzie Waalera Rosego wykorzystuje się stabilizowane erytrocyty barana uczulone
(opłaszczone) króliczymi przeciwciałami IgG przeciwko erytrocytom barana, które aglutynują w
momencie zmieszania z próbką zawierającą RF

Wykonanie oznaczenia:

Metoda jakościowa:



Pozwolid, aby odczynniki i próbki osiągnęły temperaturę pokojową. Czułośd testu może byd obniżona w
niskiej temperaturze.



Nanieśd 50 μl próbki i po jednej kropli

kontroli dodatniej

i

ujemnej

na oddzielne koła płytki testowej.



Wstrząsnąd delikatnie odczynnikiem WR przed użyciem i nanieśd 1 kroplę tego odczynnika obok
badanej próbki.



Wymieszad obie krople mieszadełkiem zajmując całą powierzchnię koła. Używad dla każdej próbki
oddzielnego mieszadełka.



Pozostawid płytkę bez poruszania na idealnie płaskiej powierzchni na 2 minuty.



Po tym czasie, bardzo ostrzożnie unieśd płytkę pod kątem 45° do poziomu jeden raz i następnie
pozostawid ją znowu na idealnie płaskiej powierzchni na jeszczę 1 minutę.

ASO-lateks – wykrywanie przeciwciał przeciw streptolizynie O



wykrywanie przeciwciał przeciw streptolizynie O



streptolizyna O

jest toksycznym, immunogennym egzoenzymem wytwarzanym przez



-hemolizujące

paciorkowce grupy A, C i G



w diagnostyce gorączki reumatycznej, ostrego zapalenia kłębków nerkowych i zakażeo
paciorkowcowych często stosuje się pomiar przeciwciał przeciwko streptolizynie O (

odczyn

antystreptolizynowy - ASO

)



w tym celu wykonywany jest test lateksowy ASO

-

cząsteczki lateksu opłaszczone streptolizyną O aglutynują po zmieszaniu z próbką zawierającą
przeciwciała ASO

Wykonanie oznaczenia:

Metoda jakościowa:



Pozwolid, aby odczynniki i próbki osiągnęły temperaturę pokojową. Czułośd testu może byd obniżona w
niskiej temperaturze.



Nanieśd 50 μl próbki i po jednej kropli

kontroli dodatniej

i

ujemnej

na oddzielne koła płytki testowej.



Wstrząsnąd delikatnie odczynnikiem ASO-lateks przed użyciem i dodad 1 kroplę tego odczynnika obok
badanej próbki.



Wymieszad obie krople mieszadełkiem zajmując całą powierzchnię koła. Używad dla każdej próbki
oddzielnego mieszadełka.



Poruszad płytką za pomocą mechanicznego rotatora przy 80-100 obr./min. przez 2 minuty. Fałszywie
dodatnie wyniki mogą pojawiad się, jeśli test jest odczytywany po upływie więcej niż dwóch minut.

2. Inne ilościowe metody wykrywania reakcji antygen-przeciwciało:

Inne ilościowe metody wykrywania reakcji antygen-przeciwciało:



Metody pozwalające na ilościową ocenę reakcji antygen-przeciwciało:

-

testy radioimmunologiczne (RIA) – polega na znakowaniu izotopem promieniotwórczym jednego z
reagentów i badaniu promieniowania związanego w wyniku reakcji

-

testy immunoenzymatyczne (EIA) – zamiast znacznika izotopowego stosuje się aktywny enzym, a
pomiar jego aktywności jest miernikiem reakcji antygen-przeciwciało



Wśród różnych modyfikacji metod radioimmunologicznych najczęściej stosowane są metody fazy
stałej, w których antygen lub przeciwciało związane są z podłożem np.:
-

płytkami plastikowymi

-

probówkami

-

krążkami bibuły

-

kuleczkami plastykowymi

Metoda radioimmunometryczna:



RIA

(

R

adio

I

mmuno

A

ssay) polega na opłaszczaniu nośnika

nieznakowanymi przeciwciałami. Po reakcji z badaną próbką (np.
zawierającą poszukiwany antygen) i dokładnym przepłukaniu ilośd
związanego antygenu wykrywa się, stosując drugie, tym razem
znakowane przeciwciało, otrzymane na innym gatunku
zwierzęcia niż użyte do opłaszczenia (przeciwciało to powinno
reagowad z innymi epitopami badanego antygenu).



Ilośd związanego znakowanego przeciwciała, a więc poziom
radioaktywności związanej z nośnikiem, jest proporcjonalna do
stężenia antygenu w badanej próbie.



Metoda ta znalazła zastosowanie, np. do oznaczeo hormonów i immunoglobulin (w tym odczynie są
one badanym antygenem) lub w diagnostyce chorób wirusowych, np. do wykrywania antygenów HBs i
HBc w wirusowym zapaleniu wątroby typu B.



Reagenty używane w metodach radioimmunologicznych najczęściej znakuje się

jodem radioaktywnym

125

J

wbudowując go do grup tyrozynowych białka po utlenieniu w obecności chloraminy T. Ta reakcja

jodowania może byd również katalizowana przez enzym laktoperoksydazę.

Metody immunoenzymatyczne:



W odróżnieniu od metod radioimmunologicznych wykorzystywany jest aktywny enzym, a nie znacznik
izotopowy np.
-

peroksydaza chrzanowa (HRP)

– substrat orto-fenylenodwuamina

-

alkaliczna fosfataza

(ALP)

– substrat para-nitrofenylofosforan),



Aktywnośd enzymu mierzy się przez fotometryczne określenie natężenia koloru zmienionego przez
enzym substratu



Najpopularniejszą metodą immunoenzymatyczną jest test

ELISA

(

E

nzyme

L

inked

I

mmunosorbent

A

ssay)

ELISA:



W metodzie tej fazą stałą (nośnikiem) najczęściej są płytki plastikowe. Pozwala to na automatyczne
rozlewanie składników, rozcieoczenie i przemywanie, a także stosowanie zautomatyzowanych
czytników spektrofotometrycznych.



W metodzie tej można określad zarówno antygen jak i przeciwciała, dzięki czemu znalazła ona szerokie
zastosowanie do oceny obecności antygenów i przeciwciał w chorobach zakaźnych np.:
-

zakażeniach HIV

-

chorobach alergicznych

-

pasożytniczych

-

do wykrywania antygenów nowotworowych

-

autoantygenów

-

do oznaczania autoprzeciwciał



Istotnym wymogiem metody ELISA stosowanej w diagnostyce klinicznej jest koniecznośd
każdorazowego ustalania granicy dodatniej (cut-off value) dla danego autoprzeciwciała na podstawie
badania dużych liczebnie populacji zdrowych dawców.

Zasada działania testu ELISA:

1. Mamy unieruchomione przeciwciało 1 na podłożu (96-dołkowa

płytka plastikowa)

2. Dodajemy badaną próbę – przyłącza się przez nas poszukiwany

specyficzny antygen dla unieruchomionego przeciwciała 1

3. Dodajemy przeciwciało 2 specyficzne dla unieruchomionego

antygenu związane z określonym enzymem (HRP – peroksydaza
chrzanowa lub ALP – alkaliczna fosfataza)

4. Po dodaniu przeciwciał 2 następuje utworzenie kompleksów immunologicznych, zatem

przeciwciało 2 także zostaje unieruchomione

5. Po wypłukaniu niezwiązanego przeciwciała 2 i dodaniu substratu dla enzymu związanego z

przeciwciałem 2 zachodzi reakcja enzymatyczna, czemu z kolei towarzyszy pojawienie się produktu
(najczęściej barwnego). Wykrycie jego obecności świadczy o obecności danego antygenu w
badanym materiale. Mierząc z kolei ilośd powstającego produktu można także przeprowadzid
analizę ilościową

Krzywa standardowa:

ELISA Virtual Lab:

http://media.hhmi.org/biointeractive/vlabs/immunology/index.html