25.02.2012

Wykład 12

Metoda spektrofotometryczna

Madaje się do pomiaru stężenia białka w płynie mózgowo-rdzeniowym nie mętnego i nie podbarwionego.

Zasada metody: W skład większości białek wchodzą aminokwasy aromatyczne (fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan). Obecność tych aminokwasów powoduje charakterystyczną absorpcję przy λ=280 nm. Nasilenie tej absorpcji jest proporcjonalne do stężenia aminokwasów, a tym samym do ilości białka.

Kwasy nukleinowe przeszkadzają przy oznaczaniu białka w ekstraktach białkowych. Jednak kwasy te dają wyższą absorpcję przy 260 nm niż 280 nm. W związku z czym możliwe jest eliminowanie ich wpływu podczas dwukrotnego pomiaru przy λ=260 i 280 nm.

C=C₂₈₀-C₂₆₀

Metody refraktometryczne

Zasada metody: Wielkość współczynników załamania (refrakcji) dla płynów ustrojowych jest wprost proporcjonalne do zawartości w nich białka. Po oznaczeniu refrakcji badanej surowicy ze specjalnych tablic odczytuje się stężenie białka w procentach.

Metody oznaczania albumin

1. Sucha chemia (surowica)

2. Metoda kolorymetryczna z zielenią bromokrezolową (surowica)

3. Metoda kolorymetryczna z czerwienią bromokrezolową (surowica)

4. Metoda elektroforetyczna (surowica)

5. Immunonefelometryczna (PMR, mocz)

6. Elektroimmunodyfuzji radialnej lub Laurella (PMR, mocz).

Metoda kolorymetryczna

Zasada metody: Zieleń bromokrezolowa reaguje w środowisku kwaśnym z albuminami surowicy, tworząc barwny kompleks. Ilość powstałych kompleksów jest wprost proporcjonalna do stężenia albumin w badanej próbce.

Odczynniki:

• odczynnik bromokrezolowy, glicyna

• surowica wzorcowa

• sól fizjologiczna.

Metody frakcjonowania białek

1. Elektroforeza

1. elektroforeza pasmowa

• na bibule

• na octanie celulozy

• na żelach: skrobiowym, agarowym, agarozowym, poliakrylamidowym

2. elektroforeza z powinowactwem

• enzym - substrat

• antygen - przeciwciało

• białko - lektyna

elektroforeza kapilarna

ogniskowanie izoelektryczne

immunoelektroforeza

immunofiksacja

Chromatografia

Ultrawirowanie

Elektroforeza

Białka są wielkocząsteczkowymi związkami amfoterycznymi, zmieniającymi swój ładunek w zależności od pH środowiska. Każde białko ma swój punkt izoelektryczny - takie pH, przy którym dodatnie i ujemne ładunki w cząsteczce się równoważą.

pI=4,6-7,9

pI=2-9 - białka osocza

pH<pI białka = kation, wędruje do katody

pH>pI białka = anion, wędruje do anody

Ruchliwość w polu elektrycznym opisywana jest wzorem:

Q - stopień zjonizowania cząsteczki

K - stała ocenia właściwości elektroosmotyczne podłoża

r - promień cząsteczki białka

η - lepkość roztworu, w którym zachodzi migracja (lepkość buforu)

suma ilości stężeń i wartościowości do kwadratu

• Elektroforeza białek polega na rozdziale białek surowicy w polu elektrycznym na różnego rodzaju podłożach w buforze o zasadowym pH.

• Jeśli po czasie trwania elektroforezy zbada się rozmieszczenie białek, to okaże się, że niektóre zawędrowały dalej, inne bliżej do anody.

• Dokonanego w ten sposób rozdziału mieszaniny białek na frakcje białkowe, z których każda zawiera inne białka.

• Białka występujące w danej frakcji mają w przybliżeniu jednakową ruchliwość elektroforetyczną.

• Rozdzielaniu w porowatym nośniku, tj. bibuła, żel agarozowy towarzyszy zjawisko elektroosmozy.

• Do celów diagnostycznych obrazy elektroforetyczne powinny być proste i zawierać niewielką ilość frakcji (5-7) dobrze oddzielonych od siebie oraz powinny być maksymalnie powtarzalne.

• Rozdzielenie takie uzyskuje się stosunkowo prosto i szybko przy użyciu octanu celulozy i żelu agarozowego (polisacharyd z agaru). Ma niewielką liczbę grup naładowanych ujemnie.

• Elektroforezie na tym nośniku towarzyszy niewielki przepływ elektroosmotyczny i większość białek po rozdziale oprócz części frakcji γ rozmieszcza się po stronie anodowej od miejsca naniesienia próbki.

1. Właściwe przygotowanie materiału do rozdziału

1. surowica - rozcieńczenie stosownym buforem

2. mocz, PMR - historycznie zagęszczenie, poprzez:

• filtry w formie probóweczek uwzględniające średnicę białka, które chcemy zagęścić (PMR)

• Aqvacid w woreczku dializującym zamykamy mocz, wkładamy do zlewki i zasypujemy preparatem, który odwadnia mocz (historycznie)

Przygotowanie aparatu do rozdziału (Backman, Cormay, Corning, Sebia)

Naniesienie surowic badanych na płytki wraz z kontrolą lub wzorcami

Przeprowadzenie rozdziału elektroforetycznego (zachowanie odpowiednich warunków czasu rozdziału)

Utrwalanie (kwas i alkohol) oraz suszenie ok. 25 minut

Barwienie (oraz fiksacja = przyklejenie białka do podłoża przez denaturację alkoholem [5% TCA] lub przez alkohol czy inny detergent zawarty w barwniku)

Densytometrowanie

Automatyczny odczyt jest korzystniejszy, bo:

• jest obiektywny

• sam wyszukuje najjaśniejszego tła

• mierzy gęstość po szczególnych plam

• podłoże przesuwa się wobec źródła światła i tworzy krzywą będącą funkcją obrysowania

• sumuje strefy elektroforetyczne

• wylicza udziały procentowe w całym układzie

• kontrolujemy w ten sposób prawidłowość rozdziału, analizując rozdział surowicy kontrolnej

techniki immunochemiczne na egzaminie

Bufor	Podłoże	Barwnik
Barbituranowy pH=8,6	bibuła Wathmann (16-18 h)	0,3% czerń amidowa 5% błękit bromofenolowy
TRIS pH=8,2	octan celulozy (40 minut)	0,3% czerń amidowy, ponseau S
Barbituranowy	żel agarozowy (25 minut)	0,3% czerń amidowa, coomassie brillant blue
TRIS	żel poliakrylamidowy	czerń amidowa, fuksja zasadowa, sudan czarny (lipoproteiny)

Bibuła

• nie można densytometrować

• 1 pasek - 1 surowica

• samodzielnie należy rozdzielić frakcje przez rozcięcie po wybarwieniu

• wyeluować

• oznaczania poprzez pomiar kolorymetryczny

• część białek wykazuje powinowactwo do bibuły i pozostaje na niej.

Octan celulozy

• między splotami włókien celulozy znajdują się przestrzenie powietrzne co powoduje łamliwość materiału

• po zanurzeniu w buforze jest elastyczny

• można densytometrować - zanurzenie w estrze acetylom etylowym nadaje przejrzystości

• stosunkowo krótki czas rozdziału - 40 minut

Żel agarozowy - biały proszek polisacharydów: α-D-galaktopiranozy, α-D-dehydrogalaktopiranozy, który rozpuszcza się w buforze - odpowiednia endosmoza.

Żel poliakrylamidowy - polimer akrylu i bisakrylamidu rozpuszczony w buforze TRIS w obecności nadsiarczanu amonu i 4-metylenodwuaminy wraz z SDS, który likwiduje ładunki. Denaturacja białka i przyłączenie siarczanów nadaje białku ładunek ujemny i przyłączenie SDS znosi ładunek warunkując wędrówkę białka tylko w zależności od masy cząsteczkowej.

Należy wykonywać krzywą kalibracji mierząc stosunek Rf

• diagnostyka białkomoczy (selektywny, nieselektywny, mieszany)

• ocena uszkodzeni bariery krew-mózg

Prawidłowy rozdział elektroforetyczny białek surowicy krwi

Do elektroforezy używa się raczej surowicy, gdyż fibrynogen jako duże białko wędruje we frakcji φ znajduje się między γ a β, co może sugerować patologiczny obraz elektroforezy (białko monoklonalne).

Z rozdziału elektroforetycznego oprócz wartości odsetkowych uzyskujemy jeszcze obraz poszczególnych frakcji.

Proteinogram informuje nas o:

• stanach ostrych

• stanach przewlekłych

• wybiórczości lub nie utraty białek z moczem

• nieprawidłowej funkcji narządów: wątroby, nerek, gruczołów dokrewnych

• patologiach układu immunologicznego

• chorobach nowotworowych

• chorobach mózgu czy opon mózgowo-rdzeniowych.

Elektroforeza z powinowactwem

• enzym-substrat
  zastosowanie: rozdział izoenzymów (CK, AMYL, ALP, LDH)

1. na odpowiednio przygotowanym podłożu agarozowym przeprowadzamy elektroforezę badanego materiału

2. potem dodajemy na podłoże substrat specyficzny dla enzymu

3. odczytu dokonujemy na fluorocytometrze przy λ=340 nm

Reakcja zachodzi na powierzchni żelu w wyniku reakcji katalizowanej przez enzym, powstaje strefa barwnego lub fluoryzującego produktu odpowiadającego swym położeniem lokalizacji produktu (najczęściej produktem jest NADPH₂). Można wykonać również na Beckmanie i dodać specjalny barwnik i wtedy różnicować na odpowiednie frakcje: kostną, wątrobową, jelitową, makromolekularną.


• białko-lektyna
  zastosowanie: glikoproteiny

1. zawierają różną ilość ugrupowań antenowych, które mają różne powinowactwo do konkaweliny A

2. 2 antenowe - mają powinowactwo

3. 3,4 antenowe - nie mają powinowactwa

1. Przygotowując żel łączymy go z przeciwciałami przeciw odpowiedniemu białku

2. Surowicę mieszamy z konkawaliną A

3. Nanosimy na żel i poddajemy elektroforezie, najdalej wędruje frakcja, która nie wiąże konkawaliny, najbliżej ta, która wiąże konkawalinę (staje się bardzo ciężka)

4. Obracamy płytkę o 90^o i poddajemy dalszemu rozdziałowi

5. Barwimy czernią amidową

Im mniej ugrupowań antenowych tym białko wędruje krócej.




Im większe stężenie tym białko wędruje dalej po odwróceniu o 90stopni.

Elektroforeza kapilarna

Elektroforeza jednokierunkowa w malutkich kapilarach o długości 22-27 cm i średnicy 50-200 μm wypełnionych bardzo różnymi nośnikami znakowanymi fluoresceiną:

4. podłoże z amfolitami

5. podłoże z żelem poliakrylamidowym z SDS (mocz)

• rozdział 5-10 minut

• materiał poddaje się wysokiemu ciśnieniu i wysokiemu natężeniu prądu w warunkach odpowiedniego chłodzenia

• odczyt pasm rozdzielanych w zasięgu promieni detektora na środkowych 20 cm kolumny z jednoczesnym porównaniem intensywności rozdzielonych pasm (ocena ich grubości i stężenia białka)

• zalety

1. szybkość rozdziału

2. szybka analiza ilościowa - ilościowy skład analizowanej mieszaniny może być dostępny po wykonanym rozdziale

3. bardzo mała objętość próbki (kilka ml) np. analiza hemoglobiny pojedynczej krwinki (zastosowanie w medycynie sądowej)

4. oszczędność odczynników - całkowita objętość kapilary wynosi ok. 5 μl

5. wiele technik detekcji, w zależności od rodzaju analizowanej substancji można zastosować odpowiednio dobrany detektor

6. możliwość automatyzacji - sterowanie rozdziałem za pomocą komputera.

Detektory

• UV-VIS

• matryce diodowe

• detektory fluorescencyjne (najczęstsza technika detekcji)

• laserowa absorpcja termooptyczna

• detektory elektrochemiczne

• spektroskop masowy

---