Sprawozdanie

Temat: Fotometryczne oznaczanie zawartości białka

Próbka nr 10

X = 3 ml białka.

A. Metoda Lowey'ego i współpracowników.

Metoda Lowey'ego i współpracowników to metoda oznaczania ilości białek. W metodzie tej wykorzystywane są dwie cechy budowy białek – obecność wiązań peptydowych oraz obecność aminokwasów aromatycznych. W metodzie tej wyróżniamy dwa etapy.

1. Zachodzi reakcja biuretowa (tworzenie barwnych kompleksów przez wiązania peptydowe i Cu²⁺)

2. Redukcja jonów miedzi Cu²⁺ do Cu⁺ w środowisku zasadowym.

Podczas drugiego etapu jony miedzi Cu⁺ katalizują reakcje utleniania przebiegającą głównie z udziałem tyrozyny i tryptofanu, redukując odczynnik Folina-Ciocalteu (kwasy fosforomolibdenowy i fsforowolframowy do odpowiednich niebieskich tlenków) Stężenie barwnego kompleksu można mierzyć przy długości fali w zakresie od 500 do 750 nm.

Absorbancja 1	Absorbancja 2	Średnia absorbancja	Ilość białka w μg odczytana z krzywej wzorcowej dla średniej absorbancji
0,398	0344	0,371	38,0

Średnia absorpcyjna: 0,371.

Ilość białka w 0,5 ml badanego roztworu białka wyniosła 38,0 μg.

W 10 ml (w kolbce) – jest odpowiednio 760 μg białka (20*38,0 μg).

W 3 ml roztworu albuminy było 760 μg białka, zatem w 1000 ml:

760 μg białka * 1000/3 = 253333,33 μg białka, czyli 253,3 mg albuminy.

W 1000 ml rozpuszczono 650 mg albuminy z surowicy bydlęcej, zatem:

650 mg – 100%

253,3 mg – x%

Obliczona czystość albuminy z surowicy bydlęcej w jej preparacie wynosi 38,96% czystego białka

B. Spektrofotometryczna metoda oznaczania białka.

Wstęp teoretyczny.

W metodzie tej zostaje wykorzystany spektrofotometryczny pomiar absorpcji promieni UV o długości 280 oraz 260 nm przechodzących przez badany roztwór białka.

Do pomiarów używane są odpowiednie kuwety, (kwarcowe lub z tworzywa sztucznego przepuszczającego promienie UV) Większość związków aromatycznych cechuje się zdolnością pochłaniania światła nadfioletowego o długości fali 280 nm. W składzie aminokwasowych białek wyróżniamy trzy aminokwasy aromatyczne: tyrozyna i tryptofan (pochłaniają światło głównie przy długości fali 280 nm) oraz fenyloalanina – najsilniej absorbuje światlo przy 260 nm.

Obliczenia

Wzór do wyliczenia przybliżonego stężenia białka w analizowanej próbce

białko [mg*ml^-1] = 1,55*A₂₈₀-0,76*A₂₆₀

A₂₈₀ = 0,119

A₂₆₀ = 0,131

białko [mg*ml^-1] = 1,55*0,119-0,76*0,131

białko [mg*ml^-1] = 0,08489 [mg*ml^-1]

W 1 ml próby znajduje się 84 μg białka.

W 10 ml (w kolbie) = 840 μg białka.

W 3 ml roztworu albuminy było 840 μg białka, zatem w 1000 ml: 840 μg * 1000/3 = 280000 μg, czyli 280,0 mg albuminy.

W 1000 ml rozpuszczono 500mg albuminy z surowicy bydlęcej, zatem:

650 mg – 100%

280,0 mg – x%

x= 43,07%

Obliczony procent czystości albuminy w surowicy bydlęcej, w jej preparacie wynosi 43,07% czystego białka.

Wnioski

Różnice w pomiarach wynikają z różnej dokładności zastosowanych metod oznaczania zawartości białka.

Metoda Lowry'ego i współpracowników jest metodą dokładną ale wymaga wiele pracy i zaangażowania. W pomiarach bardziej dokładnych oraz do oznaczeń stężeń białka w homogenatach należy stosować właśnie metody kolorymetryczne w zależności od rodzaju materiału biologicznego i dostępności białka wzorcowego, a nie metodą spektrofotometryczną która jest wprawdzie metodą szybką, ale i obarczoną dużym błędem pomiaru.