LABOLATORYJNE METODY
DIANOZOWANIA CHORÓB
ZAKAŹNYCH

Metody pośrednie

Badania labolatoryjne - podstawowe
znaczenie w rozpoznawaniu, zapobieganiu
i zwalczaniu chorób zakaźnych zwierząt.

Wybór testów labolatoryjnych

zależy od :

•

Specyfiki i rodzaju celu, który

zamierza się osiągnąć

•

Rodzaju dostarczanych próbek

do labolatorium

Metody labolatoryjne cechują się
różnym zakresem możliwości:

•

Dostarczają wyniku dodatniego lub
ujemnego np. izolacji lub braku izolacji
chorobotwórczego drobnoustroju

•

Dają wyniki ilościowe, wyrażane różnym
stężeniem przeciwciał- ich zróżnicowanym
mianem np. testy serologiczne.

AGLUTYNACJA

•

Interakcja powierzchownych antygenów

związanych z nierozpuszczalną cząsteczką

( np.komórką ) z przeciwciałem swoistym

dla tych antygenów powoduje aglutynację

cząsteczek. Test aglutynacji ma

zastosowanie w badaniach krwi oraz

oceny, czy obecność we krwi przeciwciał

skierowanych przeciwko bakteriom wynika

z infekcji tymi bakteriami.

•

Zastosowanie: serodiagnostyka brucelozy,

leptospirozy, salmonelozy

ODCZYN WIĄZANIA
DOPEŁNIACZA

•

Służy do wykrywania i określania albo
przeciwciał w badanej surowicy ,albo
antygenu w badanym materiale.

•

Związany ze zjawiskiem lizy krwinek
czerwonych uczulonych swoistym
przeciwciałem.

•

Obejmuje dwa układy –pierwszy –testowy:
antygen( drobnoustroje żywe lub zabite
ewentualnie ich wyciągi)

OWD

•

Badana surowica inaktywowana
(pozbawiona dopełniacza)

•

Świeża surowica świnki morskiej- źródło
komplementu.

•

Jeżeli zwierzę ma w surowicy przeciwciała
to wówczas wiążą one swoisty antygen, a
powstały kompleks immunologiczny
przyłącza w całości dopełniacz

OWD

•

DRUGI- układ wskaźnikowy zawiera

zawiesinę czerwonych krwinek barana

oraz tzw.amboceptor hemolityczny

(inaktywowana surowica królika

uodpornionego krwinkami baranimi)

•

W przypadku związania dopełniacza w

pierwszym układzie, uczulone krwinki

układu wskaźnikowego nie ulegną lizie

( natomiast liza krwinek w drugim układzie

świadczy o braku swoistych przeciwciał w

ukł.testowym

OWD ZASTOSOWANIE

•

Diagnostyka chorób zakaźnych:
bruceloza, nosacizna, choroba
pęcherzykowa świń

•

Określanie serotypów poszczególnych
drobnoustrojów: wirus pryszczycy, wirus
osutki pęcherzykowej u świń

IMMUNODYFUZJA W ŻELU
AGAROWYM

•

TEST PODWÓJNEJ IMMUNODYFUZJI

•

Antygen i surowica umieszczone są w
basenikach wyciętych w żelu, skąd
dyfundują we wszystkich kierunkach.

•

Na granicy zetknięcia się antygenu z
przeciwcialem tworzy się linia
precypitacyjna.

•

Preparaty zawierające różne frakcje
antygenowe będą dawać kilka prążków.

IMMUNODYFUZJA

•

Dzięki temu można stwierdzić liczbę

antygenów w badanym materiale jak

również ustalić ich stopień pokrewieństwa

antygenowego.

•

Metoda ta służy do badania struktury

antygenowej drobnoustrojów : włoskowca

różycy, wirusa pryszczycy oraz celów

diagnostycznych

•

Przy użyciu swoistych antygenów można

wykazać obecność swoistych przeciwciał

(niedokrwistość zakaźna, białaczka

)

IMMUNOFLUORESCENCJA

•

Stosuje się mikroskop fluorescencyjny i
przeciwciała znakowane fluorochromem.

•

W większości przypadków stosuje się
przeciwciała monoklonalne, które
wykazują dużą swoistość w stosunku do
określonych antygenów i epitopów.

IMMUNOFLUORESCENCJA:

•

BEZPOŚREDNIA- przeciwciała

bezpośrednio znakowane fluorochromem

•

POŚREDNIA- w pierwszym etapie

znakowania stosuje się czyste

przeciwciało , a następnie po odpłukaniu

nie znakowanego przeciwciała dodaje się

drugie przeciwciało znakowane

fluorochromem, które reaguje z pierwszym

przeciwciałem

Metoda pośrednia charakteryzuje się

większą czułością

IMMUNOFLUORESCENCJA

•

Znakowane fluorochromem przeciwciała
przeciwko powierzchownym cząsteczkom
( np. związanym z nowotworem) jest bardzo
użyteczne w badaniu wycinków tkanek czy
komórek wykazujących ekspresję antygenu.

•

Test wykonuje się inkubując próbki tkanki ze
znakowanym przeciwciałem lub nie
znakowanym i znakowanym.

•

Ocena pod mikroskopem fluoroescencyjnym.

ZASTOSOWANIE
IMMUNOFLUORESCENCJI

•

BEZPOŚREDNIEJ-badanie kału na
obecność prątków gruźlicy, tk. Mózgowej
przy podejrzeniu o listeriozę, narządów
wewnętrznych w poszukiwaniu bakterii
beztlenowych, wykrywanie wirusa
wścieklizny, pomoru świń

SERONEUTRALIZACJA (SN) =
ODCZYN NEUTRALIZACJI (VN)

•

Jego istotą jest zobojętnianie wirusa przez
swoiste przeciwciała na skutek czego
mieszanina nie ma właściwości
zakaźnych. Odczyn ten wykrywa
przeciwciała Ig Y.

•

Jest stosowany do oceny stanu
uodpornienia po szczepieniu, identyfikacji
wirusa jego serotypu czy szczepu.

SERONEUTRALIZACJA

•

Wykrywamy przeciwciała neutralizujące
patogen

•

Można określić miano przeciwciał ( test
indywidualny)

PRECYPITACJA

•

Jeżeli w środowisku znajduje się
wystarczająca ilość antygenu i przeciwciał
( równowaga) tworzą się duże agregaty,
które są nierozpuszczanle w wodzie i
ulegają precypitacji.

•

Powstaje struktura siatkowa i
precypitacja- podstawa wielu testów
służących do jakościowej i ilościowej
analizy Ag i Ab

PRECYPITACJA

•

Testy wykonuje się w półpłynnym żelu z
zagłębieniami, do których dodawany jest
Ag i/lub Ab.

•

Jeżeli Ag i Ab znajdują się w równowadze,
następuje dyfuzja i precypitacja.

IMMUNODYFUZJA RADIALNA-
modyfikacja testu precypitacji

•

Pozwala na ilościową ocenę reakcji.

•

Przeciwciało znajduje się w żelu, a antygen

podawany jest do zagłębień w żelu.

•

Antygen dyfunduje z zagłębienia do żelu i

reaguje z obecnym tam przeciwciałem

tworząc pierścień precypitacyjny ,którego

średnica zależy od stężenia Ag.

•

Umieszczając żel w polu elektrycznym

można spowodować przyspieszone

poruszanie się antygenu w żelu

zawierającym przeciwciało.

IMMUNOELEKTROFOREZA

•

Ag umieszczony jest w zagłębieniu w żelu
( bez Ab)

•

Wykonuje się elektroforezę, po której do
rowka znajdującego się obok zagłębień
dodaje się przeciwciała.

•

Przeciwciała dyfundują bocznie w kierunku
antygenu, następuje tworzenie siateczki i
precypitacja ( tworzą się łuki
precypitacyjne) pozwalając ocenić
charakter antygenu.

TEST ELISA-
IMMUNOENZYMATYCZNY
TEST RIA-
RADIOIMMUNOLOGICZNY

•

Obecność w surowicy chorych przeciwciał
przeciwko określonym antygenom można
badać za pomocą bardzo czułych testów
radioimmunologicznych ( RIA) lub testów
immunoenzymatycznych ( ELISA)

•

Testy te mają szczególne znaczenie w
identyfikacji przeciwciał przeciwko
antygenom organizmów wywołujących
infekcję, jak wirusy, bakterie.

TESTY RIA,ELISA

•

Można również badać obecność

przeciwciała o określonym izotypie stosując

modyfikacje tych testów.

•

Pozwalają swoiście i z dużą czułością

mierzyć toksyny, leki, hormony, pestycydy

nie tylko w surowicy , ale również w wodzie

,pożywieniu i innych produktach

pokarmowych.

•

Opierając się na tych testach, można

opracować testy badające prawie wszystkie

przeciwciała lub antygeny.

TEST ELISA

•

Wykonywany jest na nośnikach stałych np.
polistyrenowe.

•

Opłaszczanie płytki antygenem

•

Naniesienie badanej surowicy

•

Dodanie antyglobuliny znakowanej enzymem

•

Dodanie sunstraktu reagującego z enzymem

•

Następuje reakcja barwna, której
intensywność ocenia się spektometrycznie.

IMMUNOBLOTTING

•

Technikę immunoblotting stosuje się do badania

cząsteczek w zawiesinie

•

Technika Western blot wymaga rozdzielenia

cząsteczek za pomocą elektroforezy na żelu z

siarczanem dodecylu sodu, przeniesienia ich na

błonę i analizy cząsteczek z użyciem testu ELISA i

RIA

•

Test jest często stosowany do potwierdzenia

obecności w surowicy pacjentów przeciwciała

przeciwko czynnikom zakaźnym (np.FIV)

•

Może być stosowany do analizy produktów

pojedyńczych komórek( np. cytokiny) oraz do oceny

charakteru komórek wytwarzających