Oznaczanie

aktywności

Wieloenzymowego

układu

fotosyntetycznego

2 fazy fotosyntezy

FAZA ŚWIETLNA

• Powstaje: NADPH

2

, ATP, O

2

• 2 rodzaje fotosyntetycznej fosforylacji:

1. Niecykliczna

-

H

2

O → O

2

-

NADP → NADPH

2

-

„Otwarty” transport elektronów → ATP

2. Cykliczna

-

„Zamknięty” transport elektronów → ATP

FAZA CIEMNA

• CO

2

→ węglowodany (cykl Calvina)

W tylakoidach gran

zlokalizowane są chlorofile

wraz z układami

fotosyntetycznymi .

Fotoukłady i anteny



Fotoukład - centra reakcji

oraz towarzyszące im anteny.



PSI



PSII



Anteny energetyczne -

kompleksy barwnikowo-

lipidowo-białkowe z

chlorofilami i barwnikami

pomocniczymi



po absorpcji kwantu światła

→stan wzbudzony barwników



przekazywany do centrum

reakcji fotochemicznej

(chlorofilu a)

Strukturachemiczna chlorofilu a oraz

b



Centrum reakcji

fotochemicznej PSI i PSII

→

chlorofil a



PSII dodatkowo

chlorofil

b

→ przesunięcie jego

maksimum absorpcji w

kierunku fal krótszych

(światła niebieskiego) (tzw.

„kompleks zbierający

energię” - duża antena o

wysokiej zawartości chl b)



Chlorofile w tych dwóch

fotoukładach wykazują

inne maksima absorpcji:



dla PSI 700 nm (P-700)



dla PSII 680 nm (P-680).

Reakcje fotochemiczne i

transport elektronów



Faza świetlna fotosyntezy

polega na wykorzystaniu

energii świetlnej do

wytworzenia związków

bogatych w energię: ATP,

NADPH

2

.



Niecykliczna fosforylacja –

1.

Redukcja NADP do NADPH

2

2.

Synteza ATP (protony ze stromy

do wnętrza tylakoidów →

gradient →ATPaza)

3.

Wydzielenie tlenu

Ten rodzaj fosforylacji był badany

w naszym ćwiczeniu

Transport elektronów i powstawanie

NADPH

2

M manganowo-białkowy

kompleks wydzielający tlen;

Y

Z

reszta tyrozynowa białka D1;

Pheo feofityna;

Q

A

, Q

B

,PQ plastochinony;

cyt b, cyt f cytochromy

Fe-S

R

bialko żelazowo-siarkowe

Rieskiego

PC plastocyjanina

A

0

chlorofil a

A

1

filochonon

F

X

, F

A

, F

B

centra Fe-S

Fd ferredoksyna

FNR reduktaza ferredoksyna –

NADP

(Hall i Rao, 1999)

Wydzielanie tlenu (PSII)

(Hall i Rao, 1999)

Synteza ATP

CF1

CF0

BADANIE

Układy badane w czasie

wykonywania ćwiczenia



Układ

fotosyntetyczny II



Układ

fotosyntetyczny I



Cały łańcuch

fotosyntetyczny

METODA

Pomiar wydzielania lub pochłaniania

tlenu

DAWNIEJ: Joseph Priestley (XVIII w.)

employees.csbsju.edu/SSAUPE/biol115/priestly.gif

Pomiar wydzielania lub pochłaniania

tlenu

OBECNIE: Elektroda tlenowa (Clarka)

(Hall i Rao, 1999)

Schemat badania

1. Oznaczanie aktywności PSII

a.

Kontrola

b.

+ DCMU

c.

+ kwas linolenowy

2. Oznaczanie aktywności całego łańcucha

a.

+ metyloamina

b.

+ DBMIB

3. Oznaczanie aktywności PSI

a.

+ DCMU

Oznaczanie aktywności PSII

KONTROLA

• Pomiar szybkości wytwarzania tlenu

• Donor e

-

:H

2

0

• Sztuczny akceptor: fenylo-p-benzochinon

•

odbiera e

-

z PSII, ale nie przekazuje ich na cytochromy

(zastępuje plastochinon) → możliwe oddzielenie PSII od PSI

•Objętość dodawanej zawiesiny

chloroplastów: 7ul
•Stężenie chlorofilu wynosi

11,368 mg/ml
•Szybkość 22,78 O

2

*h

-1

*mg

-1

•Objętość dodawanej zawiesiny

chloroplastów
1. odc. 6ul
2. odc. 12ul
•Stężenie chlorofilu wynosi 7,8

mg/ml
•Szybkość (odc.1) 35,66 O

2

*h

-1

*mg

-

1

Oznaczanie aktywności PSII

+ DCMU

• Pomiar szybkości wytwarzania tlenu

• Donor e

-

:H

2

0

• Sztuczny akceptor: fenylo-p-benzochinon

•

odbiera e

-

z PSII, ale nie przekazuje ich na cytochromy

(zastępuje plastochinon) → możliwe oddzielenie PSII od PSI

• DCMU → inhibitora PSII, który blokuje miejsce

przyłączenia plastochinonu w PSII uniemożliwiając

transport e

-

na PSI

Sztuczny

akceptor

DCMU dodawano w

objętości 5ul w

odstępach ok. 1

minutowych

Odc. 3 +DCMU 5ul (kolejne odc.

+5ul)

•Punkty na wykresie

odpowiadają spadkowi szybkości

wydzielania tlenu przy

dodawaniu kolejnych porcji 5ul

DCMU
•Stężenie DCMU przy którym

obserwuje się hamowanie

reakcji w 50% wynosi 103 nM.

Oznaczanie aktywności PSII

+ kwas linolenowy

• Pomiar szybkości wytwarzania tlenu

• Donor e

-

:H

2

0

• Sztuczny akceptor: fenylo-p-benzochinon

•

odbiera e

-

z PSII, ale nie przekazuje ich na cytochromy

(zastępuje plastochinon) → możliwe oddzielenie PSII od PSI

• Kwas linolenowy → jego ogon hydrofobowy posiada

zdolność do penetracji i niszczenia błon lipidowych

1. etap: zwiększenie dostępności światła do błon tylakoidów i

przyspieszenie reakcji

2. etap: degradacja układu i zahamowanie reakcji

•Przyspieszenie reakcji po

dodaniu kwasu linolenowego:

etapy 2 oraz 3
•Hamowanie reakcji: etapy 4

oraz 5
•Całkowite zahamowanie

reakcji od etapu 6

•Przyspieszenie reakcji po

dodaniu kwasu linolenowego:

etapy 1-5 (c kw. linol.=25ug/ml)
•dodanie drugiej porcji
•Hamowanie reakcji: etapy 5-9

(c=50ug/ml)
•Całkowite zahamowanie reakcji

od etapu 8

Układ

pomiarowy

PSII

Szybkość reakcji

O

2

*h

-1

*mg

-1

chlorofilu

% kontroli, stopień

hamowania lub

stymulacji

KONTROLA

22,78

100%

49,21

100%

33,27

100%

35,41

100%

+DCMU

(całkow.

zaham. przy

c= 0,16

µmol/ml)

Szybkość reakcji maleje wykładniczo wraz ze stężeniem

inhibitora

[przy stęż. 246nM: 4,4 (19,3%)]

[48,7 (99%); 34,3 (70%); 17,1 (35%); 12,1 (25%); 10,6

(22%); 8,7 (18%0; 6,4 (13%); 0 (0%)]

[23,96 (72%); 13,5 (40%); 6,7 (20%)]

[19,7 (56%); 12,4 (35%)]

+kwas

linolenowy

(c= 0,089 –

0,178 µmol/ml)

Stymulacja 31,47

73,71% (?)

Hamowanie 3,88

78,6% (?)

Stymulacja 72,82

116%

Hamowanie 0

100% hamowania

Stymulacja 40,92

151,12%

Hamowanie -1,81

100% hamowania

Stymulacja 34,82

109,14%

Brak danych

Pseudocykliczny transport

elektronów

Reakcja Mehlera



Przeniesienie e- bezpośrednio z kompleksu PSI na cząsteczkę tlenu
(powstaje anionorodnik ponadtlenkowy)

2 MV

+

+ 2O

2

→ 2 MV

2+

+ 2 O

2.-



Anionorodnik ponadtlenkowy przekształca się w nadtlenek wodoru w
wyniku reakcji katalizowanej przez miedziano-cynkową dysmutazę
ponadtlenkową.

2 O

2.-

+ 4H

+

→ 2 H

2

O

2

+ 2O

2



Redukcja nadtlenku wodoru zachodzi dzięki
tylakoidalnej peroksydazie askorbinianowej,
która jednocześnie powoduje utlenienie
askorbinianu
(powstaje monodehydroaskorbinian -MDHA).

2 H

2

O

2

→ 2 H

2

O + O

2

Oznaczanie aktywności całego

łańcucha +metyloamina

• Pomiar szybkości pobierania tlenu

• Donor e

-

:H

2

0

• Sztuczny akceptor: metylowiologen (reakcja

Mehlera)

• Czynnik rozprzęgający: metyloamina

• Zatrzymuje syntezę ATP: ułatwia ruch protonów

przez błony → ogranicza gradient protonów

• Możliwy pomiar fosforylacji niecyklicznej

(zablokowana fosforylacja cykliczna, w której

powstaje tylko ATP)

Metyloamina c=3mM

Odc. 3 +metyloamina

Odc. 4, 6 + kolejne porcje

chloroplastów

Oznaczanie aktywności całego

łańcucha

+DBMIB

• Pomiar szybkości pobierania tlenu

• Donor e

-

:H

2

0

• Sztuczny akceptor: metylowiologen (reakcja

Mehlera)

• Inhibitor: DBMIB

• hamuje utlenianie PQ, zatem uniemożliwia transport

e

-

z PQ do kompleksu cytochromów bf, blokując PSI

2ul 5mM DBMIB (c=0,01µM)

Odc4 +DMBIB

Cały łańcuch

Układ pomiarowy

Szybkość reakcji

O

2

*h

-1

*mg

-1

chlorofilu

% kontroli, stopień

hamowania lub

stymulacji

+ metyloamina

(bez -2,7) -6,39

137,13% stymulacja

(bez -14,88) -36,35

244% stymulacja

(bez -18,8) -21,81

115,98% stymulacja

+DBMIB

(bez -14,51) -0,34

2,34% hamowanie

(bez -16,69), -1,11

6,65% hamowanie

(bez -12,2) -2,77

22,73% hamowanie

Oznaczanie aktywności PSI

• Pomiar szybkości pobierania tlenu

• Donor e

-

:TMPD (+askorbinian – pozwala utrzymywać

TMPD w formie zredukowanej)

• Sztuczny akceptor: metylowiologen (reakcja

Mehlera)

• Inhibitor PSII: DCMU

•3ul 8mM DCMU
(c=0,012umol/ml)

PSI

Układ pomiarowy

Szybkość reakcji

O

2

*h

-1

*mg

-1

chlorofilu

% kontroli, stopień

hamowania lub

stymulacji

DCMU

-36,31

Oznaczanie aktywności

(bez stymulacji, bez

inhibicji)

-29,45

-43,01

Bibliografia

• Hall, D.O., Rao K.K. (1999). Fotosynteza. WNT.

• Garstka, M. Strukturalne podstawy reakcji świetlnych fotosyntezy.

Postępy Biologii Komórki 34 (2007) 445-476.

• Hipkins M. F., Baker N. R. Photosynthesis energy trunsduction. A

practical approach. str. 117-154.

• Nicholls D., Ferguson, S. (1995) Bioenergetyka 2. PWN: str. 199-

211.

• Kopcewicz J., Fizjologia roślin str. 272-291 (PWN, 2009)

• Internetowe źródła rysunków (slajdy 1-8, 9)

http://www.helpsavetheclimate.com/photosynthesis.html,

http://pl.wikipedia.org/wiki/Tylakoid,

http://pl.wikipedia.org/wiki/Wiolaksantyna,

http://pl.wikipedia.org/wiki/Fikocyjanina , http://www.food-

info.net/pl/colour/chlorophyll.htm,

http://www.gdynia.mm.pl/~drake87/drake87/3/36/3603001.htm,

http://pl.wikipedia.org/wiki/Fotosynteza,

http://pl.wikipedia.org/wiki/Plik:Fotouk%C5%82ad_1.svg,

http://pl.wikipedia.org/wiki/Fosforylacja_fotosyntetyczna,

http://owocewarzywakwiaty.pl/warzywa/artykuly/a/pokaz/c/article/ar

t/mszyce-i-wciornastki-grozne-na-grochu.html

Dziękujemy!