Metody hodowli i

Metody hodowli i

identyfikacji

identyfikacji

bakterii

bakterii

Metody stosowane w

Metody stosowane w

diagnostyce

diagnostyce

mikrobiologicznej

mikrobiologicznej

metody mikroskopowe

metody mikroskopowe

metody izolacji na odpowiednich pożywkach

metody izolacji na odpowiednich pożywkach

identyfikacja biochemiczna

identyfikacja biochemiczna

( testy paskowe API 20 NE, API 20 E, IDE 32 STAPH, inne )

( testy paskowe API 20 NE, API 20 E, IDE 32 STAPH, inne )

metody immunologiczne

metody immunologiczne

genetyczne ( wykorzystywane coraz

genetyczne ( wykorzystywane coraz

częściej, wykorzystywane w metodach

częściej, wykorzystywane w metodach

badawczych )

badawczych )

metody biologiczne ( obecnie rzadko )

metody biologiczne ( obecnie rzadko )

( --------

( --------

stosowane rutynowo w diagnostyce )

stosowane rutynowo w diagnostyce )

1.

Bezpośrednie badanie mikroskopowe materiału od chorych = wstępne

różnicowanie drobnoustrojów (nie określają czynnika etiologicznego)
2. Metody immunologiczne - umożliwiają wykrycie antygenów bakteryjnych
wskazujących na określony gatunek drobnoustrojów
(nie zastępują metod hodowlanych)
3. Metody hodowlane (=konwencjonalne)

wyosobnienie identyfikacja określenie oporności na antybiotyki

hodowla bakteryjna test identyfikacyjny antybiogram

Minimalny czas na identyfikację to 36-48 godzin !!!!!!

Identyfikacja biochemiczna

Identyfikacja biochemiczna

drobnoustrojów

drobnoustrojów

Oparta jest na podstawie cech metabolicznych bakterii. Przy

Oparta jest na podstawie cech metabolicznych bakterii. Przy

określaniu właściwości biochemicznych wykorzystujemy różnice w

określaniu właściwości biochemicznych wykorzystujemy różnice w

aktywności enzymatycznej pomiędzy gatunkami bakterii,

aktywności enzymatycznej pomiędzy gatunkami bakterii,

najczęściej poprzez wykrywanie końcowych produktów

najczęściej poprzez wykrywanie końcowych produktów

metabolizmu wykrywamy jakie związki drobnoustrój rozkłada.

metabolizmu wykrywamy jakie związki drobnoustrój rozkłada.

Identyfikację biochemiczną wykonuje się:

a) na podłożach diagnostycznych, które zawierają:

składniki odżywcze, substrat, w stosunku do którego badamy

aktywność enzymatyczną, wskaźnik (np. błękit
bromotymolowy,
czerwień fenolowa itp.), który zmieniając swe
zabarwienie
informuje o zachodzących zmianach,
b) za pomocą tzw. szeregów biochemicznych,
c) za pomocą gotowych mikrotestów chromogennych
(np. Api STAPH, Api STREP, Api NE, Api E, Api A, ID 32E, ID 32
STAPH, ID 32GN itp.)

Identyfikacja

Identyfikacja

biochemiczna

biochemiczna

testy paskowe API 20

testy paskowe API 20

NE, API 20 E, IDE 32

NE, API 20 E, IDE 32

STAPH, inne

STAPH, inne
Testy te zawierają

zliofilizowane

substraty i wskaźniki

biochemiczne, do

których dodaje się

zawiesinę bakteryjną.

Punkty prób

dodatnich tworzą kod

cyfrowy

odpowiadający

konkretnym

bakteriom.

Właściwości danego organizmu

Właściwości danego organizmu

można badać tylko wtedy, gdy

można badać tylko wtedy, gdy

uzyskuje się na podłożu czystą

uzyskuje się na podłożu czystą

hodowlę tzw.

hodowlę tzw.



MONOKULTURĘ

MONOKULTURĘ

( wolną od innych szczepów bakteryjnych ).

( wolną od innych szczepów bakteryjnych ).

W każdej metodzie hodowli ważna jest :

• izolacja czystych kultur

• wybór odpowiedniego podłoża

Mixed
colonies

colony

colony

Colony forming units

Colony forming units

TECHNIKI POSIEWU

TECHNIKI POSIEWU

Posiewu materiałów oraz posiewu bakterii lub grzybów na

Posiewu materiałów oraz posiewu bakterii lub grzybów na

podłoża stałe dokonuje się przy użyciu ezy (platynowe, z

podłoża stałe dokonuje się przy użyciu ezy (platynowe, z

drutu Kanthalowego, plastykowe jednorazowego użytku).

drutu Kanthalowego, plastykowe jednorazowego użytku).

Posiew murawowy

Posiew redukcyjny

Posiew redukcyjny

Posiew redukcyjny

Posiew redukcyjny

umożliwia uzyskanie

umożliwia uzyskanie

czystej kultury

czystej kultury

bakterii. Wykonuje się

bakterii. Wykonuje się

go na podłożu

go na podłożu

agarowym na płytkach

agarowym na płytkach

Petriego.

Petriego.

Należy pamiętać, że

Należy pamiętać, że

każdorazowo przed

każdorazowo przed

rozsianiem materiału

rozsianiem materiału

opalamy ezę w

opalamy ezę w

płomieniu palnika!!!

płomieniu palnika!!!

Posiew redukcyjny

Posiew rysowy- przeprowadza

Posiew rysowy- przeprowadza

się na powierzchni skosu

się na powierzchni skosu

agarowego

agarowego

Posiew kłuty

Posiew kłuty

- wykonuje się

- wykonuje się

wkłuwając ezę w słupek

wkłuwając ezę w słupek

Warunki hodowli

Warunki hodowli

drobnoustrojów

drobnoustrojów

tlenowe

tlenowe



bakterie psychrofilne - rozmnażają się w

bakterie psychrofilne - rozmnażają się w

temperaturze 0 - 20

temperaturze 0 - 20





C

C



bakterie mezofilne - wzrastają w zakresie

bakterie mezofilne - wzrastają w zakresie

temperatur 20 - 45

temperatur 20 - 45





C (optimum 35 - 37

C (optimum 35 - 37





C)

C)



bakterie termofilne - wzrastają w zakresie

bakterie termofilne - wzrastają w zakresie

temperatur 30 - 90

temperatur 30 - 90





C (optimum 50 - 70

C (optimum 50 - 70





C)

C)

mikroaerofilne - eksykatory, cieplarki z

mikroaerofilne - eksykatory, cieplarki z

przepływem CO2

przepływem CO2

beztlenowe - anaerostaty, GasPak

beztlenowe - anaerostaty, GasPak

tioglikolan sodowy

tioglikolan sodowy

Cechy charakterystyczne

Cechy charakterystyczne

podłoża

podłoża

Odpowiednia zawartość substancji

Odpowiednia zawartość substancji

odżywczych

odżywczych

Odpowiednie pH ( większość bakterii wymaga

Odpowiednie pH ( większość bakterii wymaga

do wzrostu ok. 7 pH,

do wzrostu ok. 7 pH,

Vibrio cholerae

Vibrio cholerae

pH 8.2 ,

pH 8.2 ,

grzyby wymagają do wzrostu kwaśnego pH,

grzyby wymagają do wzrostu kwaśnego pH,

przy którym nie rosną bakterie )

przy którym nie rosną bakterie )

Klarowność

Klarowność

Jałowość

Jałowość

Odpowiednia (optymalna) temperatura

Odpowiednia (optymalna) temperatura

inkubacji

inkubacji

Krzywa rozwoju populacji bakterii w podłożu

Krzywa rozwoju populacji bakterii w podłożu

płynnym

płynnym

1.

1.

Faza zastoju (lag faza): przez kilka pierwszych godzin od chwili posiewu

Faza zastoju (lag faza): przez kilka pierwszych godzin od chwili posiewu

populacja bakterii nie rozwija się. W tym czasie następuje

populacja bakterii nie rozwija się. W tym czasie następuje

dostosowanie aparatu enzymatycznego komórki do nowych warunków

dostosowanie aparatu enzymatycznego komórki do nowych warunków

środowiska. Komórki powiększają swoją objętość.

środowiska. Komórki powiększają swoją objętość.

2.

2.

Faza wzrostu logarytmicznego (log faza): po kilku godzinach populacja

Faza wzrostu logarytmicznego (log faza): po kilku godzinach populacja

zaczyna się dynamicznie powiększać. Podziały przebiegają z

zaczyna się dynamicznie powiększać. Podziały przebiegają z

maksymalną możliwą częstością np. u

maksymalną możliwą częstością np. u

E. coli

E. coli

co 25 minut. Liczba

co 25 minut. Liczba

bakterii wrasta logarytmicznie.

bakterii wrasta logarytmicznie.

3.

3.

Faza stacjonarna: tempo podziałów stopniowo spada, coraz więcej

Faza stacjonarna: tempo podziałów stopniowo spada, coraz więcej

komórek obumiera wskutek nagromadzenia w podłożu szkodliwych

komórek obumiera wskutek nagromadzenia w podłożu szkodliwych

metabolitów i wyczerpywania się składników odżywczych. Liczba

metabolitów i wyczerpywania się składników odżywczych. Liczba

bakterii ≈ const

bakterii ≈ const

4.

4.

Faza starzenia się (zaniku, inwolucji): podłoże staje się coraz uboższe w

Faza starzenia się (zaniku, inwolucji): podłoże staje się coraz uboższe w

składniki odżywcze i coraz bardziej zanieczyszczone metabolitami.

składniki odżywcze i coraz bardziej zanieczyszczone metabolitami.

Czas generacji wydłuża się, obumieranie zaczyna przeważać nad

Czas generacji wydłuża się, obumieranie zaczyna przeważać nad

podziałami, liczba bakterii w podłożu wyraźnie spada. Komórki tracą

podziałami, liczba bakterii w podłożu wyraźnie spada. Komórki tracą

swe charakterystyczne właściwości.

swe charakterystyczne właściwości.

Krzywa rozwoju populacji bakterii w podłożu

Krzywa rozwoju populacji bakterii w podłożu

płynnym

płynnym

Podział podłóż

Podział podłóż

ze względu na konsystencję

ze względu na konsystencję

płynne ( bulion mięsny, bulion drożdżowy)

płynne ( bulion mięsny, bulion drożdżowy)

półpłynne ( 0,5 – 1% agaru - w takich

półpłynne ( 0,5 – 1% agaru - w takich

podłożach badamy ruchomość bakterii,

podłożach badamy ruchomość bakterii,

posiewa się przez nakłucie )

posiewa się przez nakłucie )

stałe ( 1,5 – 3% agaru, żelatyna, żel

stałe ( 1,5 – 3% agaru, żelatyna, żel

krzemionkowy)

krzemionkowy)





płytki Petri’ego

płytki Petri’ego





skosy

skosy

Podziały podłóż:

Podziały podłóż:

ze względu na zawartość substancji

ze względu na zawartość substancji

syntetyczne - znamy skład

syntetyczne - znamy skład

chemiczny jakościowy i ilościowy

chemiczny jakościowy i ilościowy

półsyntetyczne - znamy tylko skład

półsyntetyczne - znamy tylko skład

związków nieorganicznych

związków nieorganicznych

naturalne - skład ilościowy i

naturalne - skład ilościowy i

jakościowy znamy w przybliżeniu,

jakościowy znamy w przybliżeniu,

składniki pochodzenia naturalnego

składniki pochodzenia naturalnego

np. mleko, krew

np. mleko, krew

Podział podłóż

Podział podłóż

ze względu na ilość i jakość składników odżywczych

ze względu na ilość i jakość składników odżywczych

PROSTE

PROSTE

( podstawowe) -

( podstawowe) -

woda

woda

peptonowa, bulion, agar

peptonowa, bulion, agar

- rosną na

- rosną na

nich organizmy o niskich wymaganiach

nich organizmy o niskich wymaganiach

odżywczych

odżywczych

ZŁOŻONE

ZŁOŻONE

(

(

wzbogacone

wzbogacone

)

)

- agar z

- agar z

krwią

krwią

(5% krew barania)

(5% krew barania)

,

,

– rosną

– rosną

organizmy o wysokich wymaganiach

organizmy o wysokich wymaganiach

odżywczych

odżywczych

- pożywka Muellera-Hintona

- pożywka Muellera-Hintona

(do

(do

antybiogramów)

antybiogramów)

Podział podłóż

Podział podłóż

ze względu na ilość i jakość składników odżywczych

ze względu na ilość i jakość składników odżywczych

WYBIÓRCZO-NAMNAŻAJĄCE

WYBIÓRCZO-NAMNAŻAJĄCE

(

(

bulion z żółcią,

bulion z żółcią,

podłoże SS )

podłoże SS )

Rosną na nich tylko wybrane bakterie, podstawą

Rosną na nich tylko wybrane bakterie, podstawą

tych pożywek są podłoża proste lub wzbogacone

tych pożywek są podłoża proste lub wzbogacone

przyspieszające wzrost jednych bakterii, a

przyspieszające wzrost jednych bakterii, a

hamujące innych np. bulion z żółcią ( dla

hamujące innych np. bulion z żółcią ( dla

Salmonella), podłoże SS

Salmonella), podłoże SS

( dla Shigella, Salmonella ) sole żółciowe hamują

( dla Shigella, Salmonella ) sole żółciowe hamują

wzrost E. coli i bakterii G (+) – kolonie przejrzyste,

wzrost E. coli i bakterii G (+) – kolonie przejrzyste,

bezbarwne, gładkie.

bezbarwne, gładkie.

WYBIÓRCZO-RÓŻNICUJĄCE

WYBIÓRCZO-RÓŻNICUJĄCE

(

(

poż. Chapmana,

poż. Chapmana,

poż,. Löwensteina i Jensena

poż,. Löwensteina i Jensena

)

)

Rosną na nich wybrane bakterie i są one

Rosną na nich wybrane bakterie i są one

różnicowane na drodze właściwości biochemicznych

różnicowane na drodze właściwości biochemicznych

Pożywka Chapmana

Pożywka Chapmana

dla gronkowców

dla gronkowców

zwiększona zawartość 7.5% NaCl hamuje

zwiększona zawartość 7.5% NaCl hamuje

wzrost większości innych drobnoustrojów

wzrost większości innych drobnoustrojów

czynnikiem różnicującym jest mannitol

czynnikiem różnicującym jest mannitol



Staphylococcus aureus rozkłada mannitol i zakwasza środowisko -

Staphylococcus aureus rozkłada mannitol i zakwasza środowisko -

duże kolonie otoczone żółtą strefą.

duże kolonie otoczone żółtą strefą.



Staphylococcus epidermidis małe kolonie bez żółtego zabarwienia.

Staphylococcus epidermidis małe kolonie bez żółtego zabarwienia.

Podłoże McConkeya

Podłoże McConkeya

dla pałeczek G (-) z rodziny

dla pałeczek G (-) z rodziny

Enterobacteriaceae – podłoże

Enterobacteriaceae – podłoże

zawiera fiolet krystaliczny,

zawiera fiolet krystaliczny,

który hamuje wzrost bakterii G

który hamuje wzrost bakterii G

(+), rosną tylko pałeczki G(-).

(+), rosną tylko pałeczki G(-).

Czynnikiem różnicującym jest

Czynnikiem różnicującym jest

laktoza – bakterie które

laktoza – bakterie które

rozkładają laktozę ( większość

rozkładają laktozę ( większość

szczepów E. coli ) dają kolonie

szczepów E. coli ) dają kolonie

różowe, laktozo (-) kolonie

różowe, laktozo (-) kolonie

przezroczyste. Pałeczki, które

przezroczyste. Pałeczki, które

rozkładają dezoksycholan sodu

rozkładają dezoksycholan sodu

dają wokół kolonii strefę

dają wokół kolonii strefę

wytrąconego kw.

wytrąconego kw.

dezoksycholowego.

dezoksycholowego.

Podłoże dla enterokoków

Podłoże dla enterokoków

z azydkiem sodu – czynnik selekcyjny

z azydkiem sodu – czynnik selekcyjny

rosną tylko paciorkowce kałowe

rosną tylko paciorkowce kałowe

( Enterococcus faecalis , E. faecium ).

( Enterococcus faecalis , E. faecium ).

Podłoże zawiera

Podłoże zawiera

eskulinę

eskulinę

, która

, która

rozkładana przez enterokoki i

rozkładana przez enterokoki i

paciorkowce gr. D daje zaczernienie

paciorkowce gr. D daje zaczernienie

podłoża.

podłoża.

Podłoże z cetrymidem

Podłoże z cetrymidem

wybiórcze dla Pseudomonas

wybiórcze dla Pseudomonas

aeruginosa

aeruginosa

inne drobnoustroje są

inne drobnoustroje są

hamowane

hamowane

Sabourauda

Sabourauda

wybiórcze dla

wybiórcze dla

grzybów

grzybów

zawiera antybiotyki

zawiera antybiotyki

hamujące wzrost

hamujące wzrost

bakterii, pH podłoża

bakterii, pH podłoża

kwaśne – hamuje

kwaśne – hamuje

wzrost bakterii.

wzrost bakterii.

PODŁOŻA SPECJALNE

PODŁOŻA SPECJALNE

hodowla bakterii o wysokich wymaganiach

hodowla bakterii o wysokich wymaganiach

wzrostowych, rosną bakterie wybredne,

wzrostowych, rosną bakterie wybredne,

podłoża te zawierają czynniki wzrostowe

podłoża te zawierają czynniki wzrostowe



Agar czekoladowy

Agar czekoladowy

dla Haemophilus i

dla Haemophilus i

Neisseria, podłoże to tworzy się przez podgrzanie

Neisseria, podłoże to tworzy się przez podgrzanie

agaru z krwią co rozkłada krwinki, uwalniając

agaru z krwią co rozkłada krwinki, uwalniając

czynniki wzrostowe dla bakterii.

czynniki wzrostowe dla bakterii.



Podłoże Loefflera

Podłoże Loefflera

dla Corynebacterium zawiera

dla Corynebacterium zawiera

ściętą surowice końską, wylewane w skosach do

ściętą surowice końską, wylewane w skosach do

diagnostyki błonicy.

diagnostyki błonicy.



Podłoże Löwensteina i Jensena

Podłoże Löwensteina i Jensena

dla wzrostu

dla wzrostu

prątków gruźlicy ( zieleń malachitowa – hamuje

prątków gruźlicy ( zieleń malachitowa – hamuje

wzrost innych bakterii ).

wzrost innych bakterii ).



Podłoże z tioglikolanem sodowym

Podłoże z tioglikolanem sodowym

( dla

( dla

beztlenowców –

beztlenowców –

Clostridium

Clostridium

)

)

TRANSPORTOWE

TRANSPORTOWE

( zawierają składniki odżywcze pozwalające na przeżycie

( zawierają składniki odżywcze pozwalające na przeżycie

bakterii)

bakterii)

TRANSPORTOWO – NAMNAŻJĄCE

TRANSPORTOWO – NAMNAŻJĄCE

( zawierają taki skład chemiczny, który dodatkowo

( zawierają taki skład chemiczny, który dodatkowo

umożliwia namnażanie się bakterii ).

umożliwia namnażanie się bakterii ).