Ćwiczenie 6 (MOiŚ)
T: Pożywki bakteriologiczne

1. Podłoża proste

a)

bulion zwykły

b)

agar zwykły

2. Podłoża wzbogacone

a)

p. na wyciągu mózgowo – sercowym (BHI – brain-heart infusion)

b)

podłoże agarowe z krwią

c)

bulion cukrowy

3. Podłoża namnażająco – wybiórcze

a)

bulion z żółcią

b)

p. Sabouraud

4. Podłoża różnicująco - wybiórcze

a)

p. Chapmana

b)

p. EMB (Levine’a)

c)

p. McConkey’a

5. Cechy dobrej pożywki:

a)

Łatwo dostępne źródła pierwiastków biogennych (C , O, H, N)

źródło azotu:



pepton (w formie proszku; hydrolizat białek - kazeiny lub białek roślinnych;

białka trawione trypsyną, chymotrypsyną, pepsyną i HCl – pozostają krótkie
oligopeptydy) 0,5-2%



sole amonowe



N2 (dla bakterii redukujących azot atmosferyczny)



ekstrakt drożdżowy



ekstrakty mięsne (dziś w postaci pasty lub proszku, dawniej odpowiednio

spreparowane mięso bez ścięgien; źródło: mocznika, kreatyny, puryn, białek i
aminokwasów, kwasów organicznych, wit. z grupy B).

b)

źródło energii

c)

źródło elektronów

d)

sole mineralne

e)

witaminy

f)

odpowiednie pH (obojętne lub zbliżone do obojętnego np. 7,2; max. 7,8) ustalane

przy pomocy NaOH lub HCl

g)

ciśnienie osmotyczne odpowiadające 0,89% NaCl. Do pożywki dodaje się 0,5%

NaCl, resztę modyfikują pozostałe składniki podłoża

h)

agar w przypadku pożywek stałych; ok. 2%

1. Podłoża proste

a) bulion zwykły



wyciąg mięsny



pepton 1%



NaCl 0,5 %



pH ustalone na 7,8

UWAGA! podczas sterylizacji pH ulega obniżeniu o około 0,5 więc
ostatecznie z 7,8 będzie 7,3



sterylizacja 121°C , 20 min.

b) agar zwykły



tak jak bulion zwykły + agar (ok 2%)

Ustalamy pH przed dodaniem agaru, rozpuszczamy w aparacie Kocha i
sterylizujemy (121 st. 20 min, 1 atm.)

2. Podłoża wzbogacone
d)

p. na wyciągu mózgowo – sercowym (BHI – brain-heart infusion)



hydrolizat z mózgów cielęcych i serc wołowych



glukoza 1%



NaCl



Pepton



Agar (opcjonalnie)

Na tym podłożu bakterie rosną bardziej dynamicznie lub prowadzi się
hodowlę tych bardziej wymagających

e)

podłoże agarowe z krwią



substancja wzbogacająca: krew ssacza (najczęściej krew barania, końska,

ludzka 5%)



pepton



NaCl

Na tym podłożu można wstępnie określić pewne cechy hodowanych bakterii.
Jeżeli pojawia się przejaśnienie wokół kolonii (tzw. halo) oznacza to
zdolność bakterii do całkowitej hemolizy erytrocytów (hemoliza beta). Jeżeli
wokół kolonii pojawia się zazielenienie, świadczy to o zdolności utleniania
hemoglobiny do methemoglobiny (Fe

2+

--------> Fe

3+

) (hemoliza alfa). Brak

jakiejkolwiek charakterystycznej reakcji czasem nazywany hemolizą gamma.
Hemoliza Alfa: Streptococcus pneumoniae

Streptococcus mitis

Hemoliza Beta: Streptococcus pyogenes

Staphylococcus aureus

Bacillus cereus

f) bulion cukrowy

Składniki jak w bulionie zwykłym oraz dodatek 1% glukozy

3. Podłoża namnażająco – wybiórcze
Wpływają negatywnie na rozwój niektórych grup bakterii jednocześnie pozwalając na
rozwój innych.

g) bulion z żółcią



30% żółci – czynnik wybiórczy



reszta jak w przypadku bulionu zwykłego

Żółć występuje w przewodzie pokarmowym i obniża napięcie

powierzchniowe wody. Zwykle tylko bakterie jelitowe przeżywają na tym podłożu
(zarówno flora bakteryjna jak i patogeny). Podłoże wykorzystywane głównie do
wybiórczej hodowli bakterii z rodziny Enterobacteriaceae.

h) p. Sabouraud



neopepton



glukoza/maltoza



agar



pH 5-6 – czynnik wybiórczy

Podłoże przeznaczone do hodowli grzybów. Bakterie nie rozwijają się na
podłożu o tak niskim pH.

4. Podłoża różnicująco - wybiórcze

i) p. Chapmana



mannitol (czynnik różnicujący)



7,5% NaCl (czynnik wybiórczy)



pepton



wyciąg mięsny



czerwień fenolowa (wskaźnik)

Służy do hodowli gronkowców. Bakterie z rodzaju Staphylococcus mogą
rosnąć w dużym stężeniu NaCl podczas gdy inne bakterie nie rozwijają się na
takim podłożu. Jeżeli gronkowce rozkładają mannitol to dochodzi do
zakwaszenia podłoża. Zmienia ono barwę z malinowej na żółtą dzięki
wskaźnikowi – czerwieni fenolowej. Gronkowce nie rozkładające mannitolu
nie zmieniają barwy podłoża.
Staphylococcus aureus – mannitolo +
S. epidermidis – mannitolo –

j) p. EMB (Levine’a)
Eosin – methylen blue



eozyna (wskaźnik)



błękit metylenowy (czynnik wybiórczy)



laktoza 1% (czynnik różnicujący)



sacharoza 1% (czynnik różnicujący)



pepton

Błękit metylenowy hamuje rozwój bakterii G+. Podłoże jest więc
przeznaczone przede wszystkim do hodowli bakterii z rodziny
Enterobacteriaceae i innych gramujemnych. Jeżeli bakterie rozkładają laktozę
lub sacharozę to zakwaszają podłoże i reaguje eozyna. Wtedy kolonie
przyjmują barwę różową, fioletową lub białą z fioletowym środekiem. E.coli
tworzy na tym podłożu kolonie z charakterystycznym, zielonkawym,
metalicznym połyskiem.
E. coli, Klebsiella sp., Citrobacter – reakcja dodatnia
Salmonella sp, Shigella sp, Pseudomonas sp – są bezbarwne na tym podłożu
(reakcja ujemna).

k) p. McConkey’a



sole żółci (czynnik wybiórczy)



fiolet krystaliczny (czynnik wybiórczy)



laktoza (czynnik różnicujący)



czerwień obojętna (wskaźnik)

Bakterie rozkładające cukier (czynnik różnicujący) rosną w postaci czerwonych kolonii. Jeżeli nie
rozkładają to są bezbarwne.

E. coli, Klebsiella sp., Citrobacter – reakcja dodatnia
Salmonella sp, Shigella sp, Pseudomonas sp – reakcja ujemna

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
OCENA CECH MORFOLOGICZNYCH KOLONII BAKTERYJNYCH

1) CECHY MORFOLOGICZNE KOLONII (określane tylko na podłożach prostych lub
wzbogaconych):

a) barwa
b) wielkość (średnica w mm)
c) kształt: okrągły, nieregularny
d) błyszczące lub matowe
e) wypukłe lub wyniosłe
f) brzegi: całobrzegie lub postrzępione



I) Agar zwykły
1) Bacillus subtilis
2) Bacillus cereus
II) Agar z krwią
1) Staphylococcus aureus
2) Staphylococcus epidermidis
3) Streptococcus pyogenes
4) Streptococcus mitis
5) B. subtilis
6) B. cereus
7) E. coli
8) Klebsiella pneumoniae
9) Proteus mirabilis
III) Podłoża wybiórczo-różnicujące. Na tych podłożach określamy tylko kolor kolonii lub podłoża.
** Podłoże Chapmana
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
** Podłoże EMB
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Proteus mirabilis
** Podłoże McConkey’a
Klebsiella pneumoniae
Escherichia coli
Proteus mirabilit

Bakterie wytwarzające endogenne barwniki – agar zwykły
Pseudomonas sp – zielone zabarwienie na zwykłym agarze. Zdolność do wytwarzania piocyjaniny i
fluoresceiny.
Micrococcus sp. – zabarwienie żółte na agarze zwykłym. Zdolność do wytwarzania sarcinoksantyny.
Serratia marcescens – wytwarza czerwony barwnik prodigiozynę