Wykład: Genetyka bakterii fermentacji mlekowej

Trochę historii

 Badania nad genetyką bakterii fermentacji mlekowej rozpoczęto dopiero na początku lat 70-tych ubiegłego stulecia.

 Pierwsze badania dotyczyły plazmidów oraz naturalnego transferu genów u laktokoków.

Obecny stan badań nad genetyką LAB

 Pogłębianie wiedzy z zakresu genetyki LAB: głównie transferu genów i inżynierii genetycznej LAB.

 To obecnie jedna z najważniejszych dziedzin mikrobiologii żywności.

Budowa komórki bakteryjnej
Geny i DNA
DNA pełni w komórce podwójną rolę:

 Stanowi materiał dziedziczny, samoodtwarzalny w procesie replikacji i przekazywany komórkom potomnym.

 Zakodowana w nim informacja jest tłumaczona na elementy funkcjonalne, tzn. białka, które z kolei określają

biologiczne właściwości komórki.

DNA występuje w komórce w postaci dwóch struktur: chromosomu i plazmidu. Różnią się one wielkością.
Chromosom bakteryjny zawiera 1-5x10

6

par zasad. Plazmid zawiera ich 10

3

– 10

5

par zasad.

Ponad 90% informacji genetycznej znajduje się w DNA chromosomalnym. Reszta na plazmidach.
Geny występujące w plazmidach mogą w istotny sposób warunkować właściwości biologiczne komórki.

 W jednej komórce występuje zwykle jedna cząsteczka chromosomu. Plazmid może występować w wielu kopiach,

nawet do kilkuset. Zdarza się, że w jednej komórce jest kilkanaście różnych plazmidów, co jest typowe dla LAB.

 Poszczególne gatunki bakterii różnią się między sobą wielkością genomu (wielkością DNA i ilością genów

kodujących informację o komórce).

Chromosom i nukleoid

 Chromosom bakteryjny (czyli pojedyncza, kolista cząsteczka DNA), zwany też genoforem jest zawarty w

nukleoidzie.

 Nukleoid jest to obszar komórki bakteryjnej (priokariotycznej) będący odpowiednikiem jądra komórkowego u

organizmów wyższych (eukariotycznych). Nie jest oddzielony od cytoplazmy otoczką jądrową.

 Nukleoid wraz z plazmidami zawiera pełną informację genetyczną komórki (genom).

Chromosom

 Jest to względnie mała, pojedyncza kolista cząsteczka DNA, o długości ok. 200 nm, zawiera 1,8 - 3,4 Mb (mln par

zasad) (dla porównania: u ludzi genom ma długość 2 metrów i wielkość 3,5 - 5,6 mld pz),

 Niezwykle długa w porównaniu do wielkości komórek bakteryjnych, niezwykle silne poskręcana (tzw. superhelikalny

DNA), co pozwala na jej upakowanie w komórce bakteryjnej.

 Około 75 - 85% DNA chromosomu bakteryjnego to geny, pozostałe 15 - 25% to tzw. międzygenowy DNA,

oddzielający poszczególne geny (w genomie człowieka te proporcje są odwrócone – tylko ok. 5% genomu koduje
jakieś białka!).

 Niektóre geny w chromosomie są pogrupowane w rodziny zwane operonami,

 Operony kodują białka związane ze sobą funkcjami, zaś geny w jednym operonie są regulowane z skoordynowany

sposób,

 Inne geny są rozmieszczone w chromosomie bakteryjnym przypadkowo.

 Terminy związane z elementami strukturalnymi chromosomu:

- introny i eksony,
- otwarta ramka odczytu (ORF),
- transpozony.

Introny i eksony

 Sekwencje kodujące informację są zwykle rozdzielone na serię odcinków DNA, zwanych eksonami.

 Eksony są porozdzielane przez introny, które nie zawierają użytecznych informacji,

 Przed wykorzystaniem informacji biologicznej genów do syntezy białka, introny muszą być usunięte z ciągu

sekwencji kodującej,

 W komórkach bakteryjnych intronów jest niewiele.

Otwarta ramka odczytu

 ORF – z ang. open reading frame,

 Jest to ciąg nukleotydów rozpoczynający się od kodonu startowego ATG i kończący kodonem końcowym. To znaczy,

że ORF określa potencjalny gen, kodujący jakiś peptyd,

 Aby dany OFR mógł być określony jako potencjalny gen musi mieć długość co najmniej 50 kodonów (kodon, inaczej

triplet, jest to sekwencja 3 nukleotydów kodująca jeden aminokwas),

 Liczba ORF w genomie wskazuje na liczbę genów kodujących białka.

Transpozony

 Są elementami sekwencji DNA zdolnymi do przemieszczania się w genomie (w bakteryjnym chromosomie i

plazmidach),

 Mogą być wstawione w dowolnym miejscu chromosomu lub przenoszone w dowolne miejsce w chromosomie

 Są to elementy niezależne – każdy transpozon koduje enzym transponazę, katalizującą transpozycję transpozonu.

 Występują w genomach wszystkich organizmów.

 Są odpowiedzialne za zmiany genetyczne.

 Istotnie wpływają na ewolucję genomów:

– plastyczność genomów
– tworzenie nowych genów
– regulacja transkrypcji

 Są narzędziem manipulacji genetycznej.

 Są najprostszymi elementami ruchomymi.

 Występują u wielu LAB,

 Znanych jest wiele rodzajów transpozonów,

 Przykładem są sekwencje insercyjne (IS, z ang. insertion sequences), które mogą być przenoszone nawet z jednej

komórki bakteryjnej do innej podczas koniugacji komórek (jednego gatunku lub gatunków blisko spokrewnionych)
przy użyciu plazmidów.

Sekwencje insercyjne (IS)

 Najprostsze z transpozonów występujące w chromosomach bakteryjnych i plazmidach.

 Kodują wyłącznie geny odpowiedzialne za mobilizację i insercję elementów. Wielkość od 768 pz do 5 kpz.

 Są odcinkami DNA, które zawierają gen kodujący transpozazę, otoczony z obu stron odwróconymi sekwencjami

powtórzonymi. Enzym ten umożliwia im przenoszenie się w dowolne miejsca DNA.

Transpozony

 Zdolność do przemieszczania się w genomie oznacza, że mogą powodować mutację genów, do których są

wprowadzone,

 Mogą kodować np. zdolność do wytwarzania nizyny, fermentacji sacharozy, oporność na bakteriofagi, antybiotyki lub

metale ciężkie (i mogą te zdolności przekazywać innym bakteriom własnego gatunku lub gatunków blisko
spokrewnionych).

 Rozprzestrzenianie się wankomycynooporności. Przykład: Gen vanB gene (z lewej) na 64 kb transpozonie jest częścią

250 kb elementu ruchomego przenoszonego z jednej komórki enterokoka do innej.

Transpozony u LAB

 U szczepów Lac. lactis spotyka się 5 różnych sekwencji insercyjnych (IS) i u większości takich szczepów występują

one w co najmniej dwóch kopiach,

 Niektóre szczepy posiadają koniugacyjne transpozony (wielkości 68 kbp),

 Sekwencje IS są stwierdzane również u bakterii z rodzaju Lactobacillus i Leuconostoc, ale nie u Str. thermophilus.

Plazmidy

 Są kolistymi, superzwiniętymi dwuniciowymi cząsteczkami DNA, występującymi obok chromosomu bakteryjnego

prawie u wszystkich bakterii.

 Są niezależnie replikowanymi cząsteczkami DNA (ich replikacja odbywa się niezależnie od replikacji chromosomu

komórki),

 LAB mają plazmidy w różnej liczbie kopii: niskokopiowe (liczba kopii 1 - 50) i wysokokopiowe (liczba kopii 100 -

x100).

 Nie są niezbędne dla życia - mogą być usunięte bez szkody dla komórki (nie kodują funkcji, które byłyby konieczne

do jej życia, ale zwiększają różnorodność zajmowanych środowisk),

 Ilość genów zgromadzonych w plazmidach odgrywa znaczącą rolę w ewolucji i zdolności adaptacyjnych komórek, w

których się znajdują.

 Niektóre małe plazmidy wykorzystują do replikacji (powielania się) enzymy komórkowe, większe plazmidy posiadają

często geny kodujące własne enzymy replikacyjne,

 Istnieje wiele różnych plazmidów bakteryjnych,

 Poszczególne gatunki bakterii mogą posiadać nawet kilka typów plazmidów, ale nie muszą posiadać wszystkich.

5 typów plazmidów
1. Typu R – zawierają geny kodujące oporność np. na antybiotyki, bakteriocyny, metale ciężkie. Mogą przenosić

oporność na antybiotyki między gatunkami bakterii, co ma ogromne znaczenie w pojawianiu się antybiotykoopornych
szczepów bakterii patogennych. Powszechne stosowanie antybiotyków w lecznictwie, doprowadziło do
rozpowszechnienia się plazmidów R wśród chorobotwórczych bakterii.

2. Typu F i umożliwiają przenoszenie genów między komórkami bakteryjnymi w procesie zwanym koniugacją. Mogą

zawierać dodatkowe geny, przejęte z chromosomu, które są przenoszone do drugiej komórki podczas koniugacji.

3. Kolicynowe – na których zlokalizowane są geny kodujące białka zabijające inne bakterie (bakterioncyny).
4. Degradacyjne – kodujące białka pozwalające metabolizować nietypowe związki chemiczne, np. toluen, nikotynę.
5. Wirulencji – kodujące zdolność wywoływania chorób.

Plazmidy u LAB

 Są powszechniejsze u laktokoków niż u pałeczek mlekowych,

 Większość szczepów laktokoków zawiera po 4 - 7 różnych plazmidów,

 Często spotykane u pałeczek mlekowych i pediokoków,

 Czasami stwierdzane u Str. thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus i pałeczek pochodzenia

jelitowego.

Plazmidy u laktokoków
Mają szczególne znaczenie, gdyż warunkują cechy użyteczne dla bakterii - kodują cechy istotne dla technologii:

 aktywność kataboliczna węglowodanów, głównie laktozy i galaktozy,

 aktywność proteolityczna,

 produkcja związków zapachowych,

 zdolność wytwarzania i oporność na substancje przeciwbakteryjne (bakteriocyny),

 oporność na bakteriofagi.

Problemy z plazmidami u LAB

 Niestabilność przemysłowych szczepów LAB pod względem cech technologicznych jest często powodowana

utratą plazmidów przez komórki bakteryjne.

 LAB posiadają 2 typy plazmidów:

- teta - o masie ponad 10 tys. par zasad, w trakcie replikacji daje 2 identyczne, stabilne cząsteczki plazmidów
- RCR (rolling-circle replicating) - o masie ok. 10 tys. par zasad, wysokokopiowe, ale niestabilne, przy zaburzeniach
w replikacji może dać komórki bezplazmidowe.

Wiadomo już, że na stabilność plazmidów w komórce wpływ ma np. mechanizm replikacji.
Plazmidy niestabilne wykorzystują mechanizm replikacji typu RCR (rolling circle replication, mechanizm toczącego się

koła).

Plazmidy stabilne - mechanizm replikacji theta.
Gubienie plazmidów przez komórki bakteryjne powoduje brak stabilności cech szczepów przemysłowych podczas

przeszczepiania i pasażowania.

Jest to powodowane tym że jedna z form pośrednich, jaka powstaje w trakcie replikacji plazmidu według mechanizmu

RCR, jest jednoniciowy DNA.

Obecność jednoniciowego DNA jest przyczyną strukturalnej i segregacyjnej niestabilności plazmidu.

 Komórka bezplazmidowa DAJE w następnym pokoleniu już tylko komórki bezplazmidowe, a ta, która zawiera

jeszcze plazmidy MOŻE dać potomstwo bezplazmidowe.

 Małe plazmidy (< 5 kb) stwierdzane u Lactobacillus sp., podobnie jak wiele innych plazmidów bakterii

Gram-dodatnich, wykazują organizację modułową i są replikowane jak plazmidy RCR.

Wymiana informacji genetycznej między LAB

 Horyzontalne przekazywanie genów - wymiana DNA między bakteriami.

- w szerokim zakresie gospodarzy - między przedstawicielami różnych gatunków, a nawet różnych rodzajów.
- w wąskim zakresie gospodarzy - w obrębie tego samego gatunku.

 Wertykalne przekazywanie genów - dziedziczenie genu przez potomstwo.

Wyróżniono trzy rodzaje horyzontalnego przekazywania genów:

 Koniugacja

 Transdukcja

 Transformacja

Koniugacja

 Koniugacja wymaga bezpośredniego kontaktu komórek. W taki sposób przekazywane są plazmidy i transpozony

koniugacyjne, które są zdolne do tworzenia i wykorzystywania mostka koniugacyjnego.

 Przenoszonym materiałem genetycznym może być plazmid lub fragment chromosomu, który jest transferowany

dzięki plazmidowi.

 Plazmid F może być autonomiczny lub zintegrowany z chromosomem bakterii (ten drugi przypadek ułatwia

przeniesienie genów do innej komórki bakteryjnej w procesie koniugacji).

Transdukcja

 LAB mogą pozyskiwać nowe geny poprzez transdukcję, czyli za pośrednictwem bakteriofagów. Zazwyczaj

przenoszony jest tylko mały fragment DNA. Nie wszystkie bakteriofagi mają zdolność do transdukcji, nie każda
bakterię można transdukować.

Transformacja

 Transformacja oznacza pobranie DNA ze środowiska, w formie rozpuszczalnego DNA, uwolnionego z komórek

bakteryjnych. Ten sposób przekazywania genów między bakteriami został wykryty jako pierwszy.

 Transformacja naturalna zachodzi w środowisku naturalnym. Bakterie mogą pobrać w ten sposób liniowy,

jednoniciowy fragment DNA przy udziale kompleksu białkowego obecnego w błonie cytoplazmatycznej.

 Transformacja sztuczna ma na celu obejście tych wyspecjalizowanych kompleksów białkowych. W celu

wprowadzenia obcego DNA do komórki stosuje się szok chemiczny lub elektryczny. W ten sposób wprowadza się
fragmenty liniowe, dwuniciowe lub całe plazmidy. Obcy fragment DNA, który dostanie się do komórki bakterii w
wyniku transformacji (naturalnej lub sztucznej), może być włączony do genomu bakterii w wyniku rekombinacji
homologicznej lub zostać zniszczony.

 W warunkach in vitro transformacja polega na wymieszaniu czystych hodowli bakteryjnych z wyizolowanym i

oczyszczonym DNA, pobranym od innych bakterii. Te komórki, które pobrały DNA, są następnie selekcjonowane i
namnażane w hodowlach.

 Metoda transformacji jest wykorzystywana w laboratoriach do mapowania (poznawania) i manipulowania informacją

genetyczną (modyfikacji genetycznych).

 Sposoby transformacji:

- kompetencja (naturalna zdolność niektórych gatunków bakterii do pobierania DNA, np. Streptococcus),
- indukcja kompetencji różnymi zabiegami (u komórek niezdolnych do kompetencji naturalnej),
- protoplastyzacja komórek Gram-dodatnich,
- elektroporacja (zmiana przepuszczalności błon biologicznych pod wpływem pola elektrycznego i transformacja
plazmidowego DNA).

Po co nam wiedza o genach LAB?

 Ułatwia lub umożliwia bardzo dokładną klasyfikację i identyfikację LAB (homologia genów, głównie

sekwencjonowanie i porównanie fragmentów restrykcyjnych 16S rDNA w reakcji PCR).

 Ale poznanie sekwencji genów to nie jest wszystko - trzeba jeszcze poznać białka, które są kodowane i ich

właściwości.

 Pozwala na poznanie narzędzi (np. wektorów plazmidowych) do udoskonalania szczepów LAB stosowanych

przemysłowo.

 Umożliwia otrzymanie nowych szczepów LAB o lepszych lub nowych właściwościach:

- zdolnościach fermentacyjnych lub wzrostowych (np. szybsza fermentacja, lepsze cechy sensoryczne żywności
fermentowanej, hamowanie rozwoju patogenów lub mikroflory psującej żywność),
- brak wytwarzania niepożądanych substancji ubocznych fermentacji, np. gorzkich peptydów,
- większej odporności na czynniki stresowe lub bakteriofagi.

 Umożliwia otrzymanie szczepów LAB o nowych właściwościach, np.:

- wytwarzania substancji antybiotycznych, utrwalających żywność, składników odżywczych (takich jak witaminy,
aminokwasy),
- rozkładania lub neutralizacji substancji szkodliwych, np. alergenów, mykotoksyn, metali ciężkich, cholesterolu.

 Możliwość wykorzystania LAB dla poprawy zdrowia ludzi (profilaktycznie i jako terapeutyki, bez skutków

ubocznych dla organizmu człowieka).

 Możliwość regulacji szlaków metabolicznych LAB

Najnowsze efekty?

 Regulacja metabolizmu aminokwasów i peptydów podczas wzrostu w mleku proteinazo-dodatnich (Prt+) i -ujemnych

(Prt-) szczepów Lactococcus lactis.



Badania nad zwalczaniem bakterii patogennych metodą alternatywną do antybiotyków, przy użyciu plazmidów,
zwaną strategią „Konia trojańskiego”. Strategia „Konia trojańskiego” polega na zabiciu patogennej bakterii przez
wprowadzenie zabójczego plazmidu przy pomocy koniugacji z komórką nieszkodliwej bakterii.

 Bakterie mlekowe być może pomogą walczyć z AIDS. Naukowcom z Brown Medical School w USA udało się

zmodyfikować bakterie mlekowe w ten sposób, że wytwarzają lek przeciwko HIV (białko nazwane cynowiryną, które
łączy się z wirusem HIV i zapobiega jego przyłączeniu do komórek błony śluzowej). Zespół naukowców dokonał
tego używając metody elektroporacji. Przez komórki bakterii, zawieszone w roztworze ochronnym (PEG, glikol
polietylenowy), przepuścili impulsy silnego prądu stałego. Spowodowało to utworzenie małych porów w błonie
komórkowej bakterii. Dzięki temu, zawieszone w roztworze cząsteczki DNA mogły wniknąć do wnętrza komórek
bakteryjnych i bakterie zaczęły produkować białko, którego gen został do nich wprowadzony.