OZNACZENIE ILO CIOWE

W HPLC

Dr in . Agata Kot-Wasik

Katedra Chemii Analitycznej,

Wydział Chemiczny ,

Politechnika Gda

ń

ska

CEL

•

Celem rozdzielania mieszaniny substancji na poszczególne
składniki, b d rozdzielenia tylko wybranych substancji od
innych, jest najcz ciej ich ilo ciowe oznaczenie, tj.

ustalenie zawarto ci lub masy w analizowanej próbce

.

•

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest
wykorzystywana do oznaczenia zawarto ci

składników głównych

wyst

ę

puj

ą

cych w próbce na poziomie

st

ę

ż

e

ń

w zakresie od 1 do 100 %,

składników po rednich

– od 0.001 do 1%

składników ladowych

substancji

obecnych w analizowanej

próbce poni

ż

ej 0.001%

Oznaczenie ilo ciowe w HPLC

polega na ustaleniu zale no ci pomi dzy

sygnałem detektora, czyli powierzchni

pod pikiem lub ewentualnie wysoko ci

piku, a st eniem lub mas składnika,

którego zawarto zamierzamy

oznaczy

.

WARUNEK OZNACZENIA ILO CIOWEGO:

1.

rozdzielenie zwi zków do podstawy

2.5

5

7.5

10

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

2.

POWIERZCHNIA CZY WYSKO

?

238 nm

254 nm

Dzisiaj

Jutro ?

Powierzchnia (A) = const.

Wysoko (H) = const.

11

11.5

12

12.5

13

13.5

14

14.5

15

15.5

16

100

200

300

400

500

600

700

800

0

2000

4000

6000

8000

cz

as

m/z

in

te

n

s

yw

n

o

ś

ć

s

yg

n

a

łu

WARUNEK OZNACZENIA ILO CIOWEGO:

3.

Zawsze dokonuje si dla tej samej (wybranej)

długo ci fali

Metody oznaczania ilo ciowego:

•

z punktu

•

metoda wzorca zewn trznego (metoda
krzywej kalibracyjnej),

•

metoda wzorca wewn trznego,

•

metoda dodatku wzorca (metoda fortyfikacji)

•

metoda prostej normalizacji lub normalizacji
ze współczynnikami korekcyjnymi

Metoda tzw. z punktu

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0

1

2

3

4

5

S

t

ę

ż

e

n

i

e

a

n

a

l

i

t

u

[

m

g

/

m

L

]

P

o

w

i

e

r

z

c

h

n

i

a

/

w

y

s

o

k

o

ś

ć

p

i

k

u

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0

1

2

3

4

5

S

t

ę

ż

e

n

i

e

a

n

a

l

i

t

u

[

m

g

/

m

L

]

P

o

w

i

e

r

z

c

h

n

i

a

/

w

y

s

o

k

o

ś

ć

p

i

k

u

Z dwóch punktów ?

Metoda wzorca zewn trznego

metoda krzywej kalibracyjnej

external standard

Istot metody wzorca zewn trznego jest wyznaczenie

zale no ci pomi dzy powierzchni (wysoko ci ) piku

dla ka dej z oznaczanych substancji i ich st eniem lub

mas .

Metoda wzorca zewn trznego

metoda krzywej kalibracyjnej

external standard

•

W tym celu przygotowuje si

ę

roztwory kalibracyjne, tzn. roztwory substancji

oznaczanej albo mieszaniny analizowanych substancji w kilku ró

ż

nych

st

ę

ż

eniach . . . .

Metoda wzorca zewn trznego

metoda krzywej kalibracyjnej

external standard

•

W tym celu przygotowuje si

ę

roztwory kalibracyjne, tzn. roztwory substancji

oznaczanej albo mieszaniny analizowanych substancji w kilku ró

ż

nych

st

ę

ż

eniach i

ka

ż

dy z przygotowanych roztworów dozowany jest do kolumny

chromatograficznej

.

Metoda wzorca zewn trznego

metoda krzywej kalibracyjnej

external standard

•

. . . Na podstawie powierzchni lub wysoko

ś

ci pików, na uzyskanych

chromatogramach wyznacza si

ę

przebieg krzywej kalibracyjnej b

ą

d

ź

oblicza

si

ę

warto

ś

ci współczynników w równaniu kalibracyjnym dla ka

ż

dej z

oznaczanych substancji.

p

o

w

ie

rzc

h

n

ia

p

iku

y = 10,2x - 0,4

R

2

= 0,9989

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0

1

2

3

4

5

S

t

ę

ż

e

n

i

e

a

n

a

l

i

t

u

[

m

g

/

m

L

]

P

o

w

i

e

r

z

c

h

n

i

a

/

w

y

s

o

k

o

ś

ć

p

i

k

u

Metoda wzorca zewn trznego

metoda krzywej kalibracyjnej

external standard

•

Nast

ę

pnie dozowane do kolumny i rozdzielane s

ą

próbki, w których oznaczona

ma by

ć

zawarto

ś

ć

wybranych substancji.

Metoda wzorca zewn trznego

metoda krzywej kalibracyjnej

external standard

•

Uzyskane powierzchnie pików
substancji oznaczanych w
nieznanej próbce umo

ż

liwi

ą

oznaczenie ich zawarto

ś

ci, tj.

st

ę

ż

enia (masy).

2.5

5

7.5

10

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

p

o

w

ie

rzc

h

n

ia

p

iku

y = 10,2x - 0,4

R

2

= 0,9989

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0

1

2

3

4

5

S

t

ę

ż

e

n

i

e

a

n

a

l

i

t

u

[

m

g

/

m

L

]

Cx

Cx

P

o

w

i

e

r

z

c

h

n

i

a

/

w

y

s

o

k

o

ś

ć

p

i

k

u

Warunki poprawnego stosowania

metody wzorca zewn trznego

•

zarówno roztwory wzorcowe, jak i analizowane próbki

musz

by rozdzielane ("chromatografowane") w tych

samych warunkach temperatury, obj to ciowego nat enie
przepływu eluentu, typu i wymiarów kolumny
chromatograficznej, z reguły tej samej kolumny, składu
eluentu oraz takiego samego programu elucji.

UWAGA !

Ekstrapolacja

przebiegu krzywej kalibracyjnej poza zakres

wykonanej kalibracji, mo e by ródłem niedokładnych

wyników oznacze ze wzgl du na nieliniowy przebieg

odpowiedzi detektora !

p

o

w

ie

rzc

h

n

ia

p

iku

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0

1

2

3

4

5

S

t

ę

ż

e

n

i

e

a

n

a

l

i

t

u

[

m

g

/

m

L

]

Cx

Cx

P

o

w

i

e

r

z

c

h

n

i

a

/

w

y

s

o

k

o

ś

ć

p

i

k

u

Metoda wzorca wewn trznego

internal standard

Jest to metoda polegaj ca na dodaniu do próbki znanej ilo ci

składnika, tzw. wzorca wewn trznego (IST), który jest

jednak inny od substancji oznaczanych i nie mo e by

obecny w analizowanych próbkach przed jego dodaniem.

•

W celu uzyskania krzywej kalibracyjnej do kilku roztworów
wzorcowych o ró

ż

nych st

ę

ż

eniach substancji oznaczanej dodaje si

ę

najcz

ę

ś

ciej stał

ą

i znan

ą

ilo

ś

ć

wzorca wewn

ę

trznego. Na podstawie

uzyskanych chromatogramów roztworów wzorcowych wykre

ś

la

si

ę

zale

ż

no

ś

ć

st

ę

ż

enia analitu w funkcji stosunku powierzchni piku

analitu i wzorca wewn

ę

trznego.

y = 10,2x - 0,4

R

2

= 0,9989

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0

1

2

3

4

5

S

t

ę

ż

e

n

i

e

a

n

a

l

i

t

u

[

m

g

/

m

L

]

Cx

Cx

p

o

w

ie

rzc

h

n

ia

p

iku

S

t

o

s

u

n

e

k

p

o

w

i

e

r

z

c

h

n

i

/

w

y

s

o

k

o

ś

c

i

p

i

k

u

a

n

a

l

i

t

u

i

w

z

o

r

c

a

w

e

w

n

ę

t

r

z

n

e

g

o

Wymagania dotycz ce wzorca

wewn trznego

•

musi by

ć

rozdzielony od innych składników wyst

ę

puj

ą

cych w próbce

•

czas retencji powinien by

ć

zbli

ż

ony do czasu retencji analitu(ów)

•

nie wyst

ę

puje w próbkach pierwotnych

•

wła

ś

ciwo

ś

ci fizyko-chemiczne s

ą

podobne do analitu. Jest to

szczególnie istotne na etapie przygotowania próbek (oczyszczania,
wzbogacania czy derywatyzacji)

•

powinien by

ć

mo

ż

liwie wysokiej czysto

ś

ci

•

stabilny chemicznie

•

odpowied

ź

detektora dla wzorca wewn

ę

trznego powinna by

ć

zbli

ż

ona

do odpowiedzi substancji oznaczanych

Metoda wzorca wewn trznego

•

ma zastosowanie szczególnie w przypadku metod
analitycznych wymagaj cych zło onej, wieloetapowej
procedury przygotowania próbki (izolacja, wzbogacanie,
derywatyzacja itp.), co mo e powodowa straty analitów

•

pozwala równie na uniezale nienie otrzymywanych
wyników od waha ilo ci dozowanej próbki

•

w praktyce metoda ta jest te bardziej pracochłonna ni
metoda krzywej kalibracyjnej

WARUNEK OZNACZENIA ILO CIOWEGO:

rozdzielenie zwi zków do podstawy

A JE LI NIE DO PODSTAWY ???

2.5

5

7.5

10

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

Metoda dodatku wzorca

standard addition

Metoda ta polega na dodaniu do próbki znanych ilo ci

substancji oznaczanych (analitów), zwykle jest to

od 50 do

150%

oczekiwanej zawarto ci oznaczanej substancji.

Po zanalizowaniu tych roztworów, na podstawie uzyskanych

chromatogramów, wykre la si krzywe kalibracyjne, tj.

zale no powierzchni piku analitu w funkcji ilo ci analitu

dodanej do próbki .

y = 120x + 22,5

R

2

= 0,9931

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

I

l

o

ś

ć

a

n

a

l

i

t

u

d

o

d

a

ne

g

o

d

o

p

r

ó

b

k

i

[

m

g

/

m

L

]

p

o

w

ie

rzc

h

n

ia

p

iku

P

o

w

i

e

r

z

c

h

n

i

a

/

w

y

s

o

k

o

ś

c

p

i

k

u

Metoda dodatku wzorca c.d.

Nast pnie przeprowadza si graficzn ekstrapolacj

krzywej kalibracyjne do punkt przeci cia z osi

odci tych i odczytuje si warto c

x

y = 120x + 22,5

R

2

= 0,9931

0

10

20

30

40

50

60

70

80

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

I

l

o

ś

ć

a

n

a

l

i

t

u

d

o

d

a

ne

g

o

d

o

p

r

ó

b

k

i

[

m

g

/

m

L

]

Cx

Cx

p

o

w

ie

rzc

h

n

ia

p

iku

P

o

w

i

e

r

z

c

h

n

i

a

/

w

y

s

o

k

o

ś

c

p

i

k

u

Metoda dodatku wzorca c.d.

Innym sposobem okre lenia zawarto ci substancji

oznaczanej w próbce bez dodatku wzorca jest

graficzne wyznaczenie przebiegu nowej linii

kalibracyjnej typu f(x)=a

1

x, o tym samym

współczynniku nachylenia prostej, co krzywa

kalibracyjna.

y = 120x + 22,5

R

2

= 0,9931

0

10

20

30

40

50

60

70

80

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

I

l

o

ś

ć

a

n

a

l

i

t

u

d

o

d

a

ne

g

o

d

o

p

r

ó

b

k

i

[

m

g

/

m

L

]

Cx

Cx

p

o

w

ie

rzc

h

n

ia

p

iku

P

o

w

i

e

r

z

c

h

n

i

a

/

w

y

s

o

k

o

ś

c

p

i

k

u

Metoda prostej normalizacji

Metoda prostej normalizacji nie jest metod kalibracji.

Nie stosuje si w niej odniesienia do znanej ilo ci wzorca.

Metoda ta umo liwia oszacowanie wzgl dnych ilo ci

substancji np. zawarto ci zanieczyszcze w badanej

próbce.

Na podstawie chromatogramu oblicza si sumaryczn

powierzchni pików, któr traktuje si jak 100% ...

A

1

A

3

A

2

A

4

A

1

+A

2

+A

3

+A

4

= 100%

1%

51%

1%

47%

a nast pnie oblicza si udział powierzchni okre lonego piku

wzgl dem sumy powierzchni wszystkich lub tylko

wybranych pików na chromatogramie.

Metoda prostej normalizacji opiera si na zało eniu,

e współczynniki odpowiedzi dla ka dego składnika

próbki s takie same, tzn. takie same st enia ró nych
substancji odpowiadaj takim samym powierzchniom
ich pików chromatograficznych.

ALE ...

Tak charakterystyk cechuje si detektor FID

stosowany w chromatografii gazowej do oznaczania

w glowodorów.

W chromatografii cieczowej metoda uproszczonej

normalizacji nie ma zastosowania.

Detektory stosowane w HPLC charakteryzuj si

zró nicowan czuło ci wzgl dem substancji.

Korzystne mo e by stosowanie metody prostej

normalizacji, gdy wykorzystywany jest

detektor

refraktometryczny

lub

detektor wiatła

rozproszonego

. Detektory te wykazuj zbli on

odpowied dla ró nych substancji o zbli onej

strukturze i masie cz steczkowej.

Metoda normalizacji ze
współczynnikami korekcyjnymi

Metoda ta polega na okre leniu wzgl dnej powierzchni

piku substancji badanej wzgl dem wybranych b d

wszystkich pików na chromatogramie

z uwzgl dnieniem

współczynników korekcyjnych, uwzgl dniaj cych

zró nicowan odpowied detektora dla ró nych

składników próbki.

Na chromatogramie mieszaniny o znanych
zawarto ciach substancji badanych oblicza si pola
powierzchni pików, a nast pnie oblicza si wzgl dny
udział procentowy poszczególnych substancji metod
prostej normalizacji. W dalszej kolejno ci oblicza si
warto współczynnika korekcyjnego dla danej
substancji korzystaj c z równania

Wyznaczanie współczynników korekcyjnych

)

(

)

(

obliczone

c

znane

c

R

i

i

fi

=

c

i

(znane) – zawarto

ś

ć

składnika i w roztworze wzorcowym,

c

i

(obliczone) – udział składnika i w rozworze wzorcowym obliczony metod

ą

prostej normalizacji

Dzi kuj za uwag .