W

YSOKOSPRAWNA

C

HROMATOGRAFIA

C

IECZOWA

materiały do ćwiczeń seminaryjno-

laboratoryjnych

Materiały zebrała i przygotowała do druku:

dr inż. Agata Kot-Wasik, Katedra Chemii Analitycznej, Politechnika Gdańska

SPIS TRE

Ś

CI

Ć

wiczenie 1

Dobór warunków rozdzielania w układzie faz odwróconych dla warunków elucji
izokratycznej i gradientowej.

Dr in

ż

. B. Makuch, mgr in

ż

. J. Wilga, mgr in

ż

. E. Gilgenast,

Ć

wiczenie 2

Rozwi

ą

zywanie problemów technicznych w HPLC. Retencja, selektywno

ś

ć

,

sprawno

ś

ć

i rozdzielczo

ś

ć

w układzie faz normalnych.

Prof. dr hab. in

ż

. M. Kami

ń

ski, mgr in

ż

. G. Romanik

Ć

wiczenie 3

Walidacja metody analitycznej wykorzystuj

ą

cej HPLC w praktyce.

Dr in

ż

. P. Konieczka, Dr M.

Ś

lebioda

Ć

wiczenie 4

Rozdzielanie, identyfikacja i oznaczenie ilo

ś

ciowe zwi

ą

zków pochodzenia

farmaceutycznego w próbkach.

Dr in

ż

. A. Kot-Wasik

Ć

WICZENIE 1

D

OBÓR WARUNKÓW ROZDZIELANIA W UKŁADZIE FAZ ODWRÓCONYCH

DLA WARUNKÓW ELUCJI IZOKRATYCZNEJ I GRADIENTOWEJ

mgr in

ż

. J. Wilga, mgr in

ż

. E. Gilgenast

Pani Joanna Wilga, Ewelina Gilgenast są doktorantkami na Studium Doktoranckim przy Wydziale Chemicznym
Politechniki Gdańskiej;

[e-mail]

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie dobór optymalnych warunków rozdzielenia substancji w układzie
faz odwróconych, na przykładzie ekstraktu z liści z Ginkgo bilobae.

Rysunek 1. Li

ś

cie Ginkgo bilobae

Już przed wiekami odkryto, że liście Ginkgo bilobae, tej najstarszej na świecie rośliny zawierają związki
flawonoidowe i terpenoidowe, które potrafią stymulować procesy pamięciowe mózgu, wpływają
pomocniczo w zwalczaniu zaburzeń obwodu krążenia krwi, a także w zaburzeniach pracy mózgu
spowodowanych zaburzeniami krążenia mózgowego, a rozmaite produkty zawierające Ginkgo robią
obecnie zawrotną karierę i są stosowane w postaci tabletek lub w roztworze.
Ekstrakty roślinne są złożonymi, wieloskładnikowymi mieszaninami związków znacznie różniących się
właściwościami chemicznymi. Dobór warunków rozdzielania może być procesem trudnym i
pracochłonnym. Na ogół bywa, że nie jest możliwe rozdzielenie w układzie izokratycznym (stały skład
fazy ruchomej) i należy stosować gradient (zmiana skokowa bądź ciągła składu fazy ruchomej).
Obecnie najczęściej stosowanymi układami rozdzielania metodą Wysokosprawnej Chromatografii
Cieczowej (HPLC) jest tzw. układ faz odwróconych (RP) i można zaryzykować stwierdzenie, ż e90%
wszystkich rozdzielań wykonuje się w tych układach z zastosowaniem fazy stacjonarnej typu RP – 18
tzn. żel krzemionkowy modyfikowany grupą oktadecylową.

W praktyce laboratoryjnej doboru faz rozdzielania dokonuje się przez:

a – zmianę składu fazy ruchomej - zmiana ilościowego udziału rozpuszczalników,
b – zmianą pH fazy ruchomej,
c- zastosowanie pary jonowej,
e – zmiana typu fazy ruchomej.

W trakcie wykonywania ćwiczenia będą uwzględniane punkty a, b, c, e. Rozpuszczalniki stosowane jako
fazy ruchomew układach RP wg ich iły elucyjnej to woda (najsłabszy) < MeOH< ACN < EtOH < THF <
iPrOH < chlorek metylenu (najsilniejszy). W praktyce najczęściej stosuje się 4 – ry rozpuszczalniki w
różnych układach tj. wodę, metanol, acetonitryl i tetrahydrofuran, a parametry retencji mogą być
regulowane składem fazy ruchomej.

Podstawowa zależność to wzrost zawartości rozpuszczalnika bardziej polarnego w fazie ruchomej obniża
wartość współczynnika retencji (k).

Bywają takie problemy rozdzielcze, które można rozwiązać poprzez zamianę rozpuszczalnika w fazie
ruchomej; można np. zamienić metanol na tetrehydrofuran. Przy założeniu stałej siły elucyjnej fazy
ruchomej korzysta się z prostej zależności:

S

T

=

ΣΣΣΣ

S

i

θθθθ

i

gdzie:
S

T

– całkowita siła elucyjna fazy ruchomej,

S

i

– siła elucyjna rozpuszczalnika

θ

i – udział molowy rozpuszczalnika w fazie ruchomej.

Przykład: mamy skład fazy ruchomej MeOH : H

2

O w stosunku objętościowym 7:3. Wówczas całkowitą

siłę elucyjną fazy ruchomej liczymy wg powyższej zależności otrzymując:

S

T

= S

MeOH

θθθθ

+ S

H2O

θθθθ

= 2,6 x 0,7 + 0 x 0.3 = 1,82

Gdy zastąpimy metanol tetrahydrofuranem przy założeniu takiej samej siły elucyjnej fazy ruchomej to
obliczenie jest następujące:
1,82 = 4,5 x X + 0 x X

→

ok. 40

czyli nowy skład fazy ruchomej będzie następujący THF : H2O 4: 6 (v/v).

Innym sposobem doboru warunków rozdzielania jest zmiana pH fazy ruchomej. W przypadku
rozdzielania związków o charakterze słabych kwasów, fazę ruchomą zakwaszamy, zaś w przypadku
rozdzielania słabych zasad fazę ruchomą alkalizujemy. Efektem takich zabiegów jest wzrost
współczynnika retencji co w konsekwencji prowadzi do rozdzielenia związków, które zbyt szybko
opuszczają kolumnę chromatograficzna. Zmiana pH powoduje cofnięcie dysocjacji.

W układach RP mogą być stosowane również inne typy faz stacjonarnych np. RP – 8, rzadziej RP

– 2, jak również żel modyfikowany grupa cyjanową lub fenylową. W każdym przypadku kolejność elucji
jest następująca: pierwsze eluują substancje polarne (hydrofilowe)a w dalszej kolejności substancje
niepolarne (hydrofobowe). W przypadku rozdzielania węglowodorów czas elucji jest zależny od długości
łańcucha fazy związanej z żelem krzemionkowym.

WYKONANIE ĆWICZENIA

W trakcie ćwiczenia dobierane będą optymalne warunki rozdzielenia substancji czynnych w ekstrakcie
Ginkgo bilobae, w układzie faz odwróconych.

Pomiar wykonany zostanie w warunkach izokratycznych,; przy mierzonej długości fali

λ

= 330 nm.

Wykorzystywane kolumny chromatograficzne:

-

LiChrospher RP-18

-

Kolumna cyjanowa

Wykorzystywane fazy ruchome:

-

MeOH : H

2

O (7:3 v/v)

-

MeOH : H

2

O (9:3 v/v)

-

MeOH: H

2

O (7:3 v/v) z dodatkiem H

3

PO

4

(1%)

-

THF:H

2

O (4:6 v/v)

-

THF:H

2

O (4:6 v/v) z dodatkiem H

3

PO

4

(1%)

-

MeOH: H

2

O (7:3 v/v) z dodatkiem H

3

PO

4

(0,1%)

-

THF:H

2

O (4:6 v/v) z dodatkiem H

3

PO

4

(0,1%)

Parametry aparatury

•

Detektor UV/DAD L – 7450 firmy Merck HITACHI

•

Pętla dozująca 20

µ

l

•

Dozownik Rheodyne 7125

•

Pompa L – 6200 firmy Merck HITACHI

Notatki własne

Ć

WICZENIE 3

W

ALIDACJA METODY ANALITYCZNEJ WYKORZYSTUJĄCEJ

HPLC

Dr M.

Ś

lebioda, dr in

ż

. P. Konieczka

Pan Marek Ślebioda jest pracownikiem Perlan Technologies Polska Sp. z o.o.
ul. Puławska 303, 02-785 Warszawa;
www.perlan.com.pl
Pan Piotr Konieczka jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
[e-mail]

Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie uczestników z możliwością automatyzacji przygotowania, wykonania i
opracowania testów związanych z walidacją metody chromatograficznej. Przeprowadzone zostanie
wyznaczenia granicy oznaczalności (LOQ) i wykrywalności (LOD) kilku związków zawartych w
mieszaninie w oparciu o metodę krzywej wzorcowej. Ogólny opis wymagań dotyczących walidacji metod
chromatograficznych można znaleźć w odpowiednich artykułach ciał normalizujących ten proces. Skrót
zawarty jest w publikacji [1].

Podstawowe definicje

Granica wykrywalności jest zdefiniowana jako ilość (lub stężenie) analitu dająca odpowiedz y

DL

znacząco różną

(trzy odchylenia standardowe s

B

) od szumu tła y

B

:

(1)

B

B

DL

s

y

y

3

=

−

Pomimo możliwosci zastosowania obliczeń elektronicznych bezpośredni pomiar y

B

oraz s

B

jest zwykle w metodach

chromatograficznych niedogodny i niedokładny ze względu na małe wielkości mierzone. Wartość s

B

może być

zastąpiona przez oszacowanie błędu standardowego s

e

z krzywej regresji ilość analitu względem

odpowiedzi:

(2)

(

)

η

−

−

=

n

y

y

s

est

obs

e

2

gdzie

y

obs

jest wartością obserwowaną

y

est

jest wartością obliczoną z krzywej kalibracyjnej

n jest liczbą punktów kalibracyjnych

η

dla regresji liniowej wynosi 2

W punkcie odpowiadającym granicy wykrywalności y

DL

= A·C

DL

+ y

B

, gdzie C

DL

jest ilością analitu odpowiadającą

granicy wykrywalności oraz A jest czułością analityczna (nachyleniem prostej regresji). Łącząc
te równania otrzymuje się:

(3)

A

s

C

e

DL

3

=

Jako granicę oznaczalności można uważać najmniejszą ilość analitu, która daje się oznaczyć z wystarczającą
precyzją (dziesięć odchyleń standardowych s

B

). Stosując oszacowanie błędu na podstawie linii regresji można ją

obliczyć jako:

(4)

A

s

C

e

QL

10

=

Program obliczeniowy

Do projektowania walidacji, zbierania danych i wykonania obliczeń zastosowany zostanie automatyczny program
obliczeniowy Method Validation Pack [i] współpracujący z programem sterującym chromatografem. Po zebraniu
danych i ich ocenie można w programie Method Validation Pack wygenerować automatycznie raport końcowy
zawierający wyniki analizy statystycznej. Dostępne w programie wzorce walidacji pozwalają na szybką
konfigurację testów zgodnie z zaleceniami ICH Q2A/2B, USP, EP, DIN oraz FDA. Istnieje możliwość dołączenia
do raportu z walidacji elektronicznych wersji standardowych procedur operacyjnych oraz innych dokumentów
związanych z procesem walidacji. Sposób działania programu przedstawiony jest schematycznie na rysunku 1.

Rysunek 1. Wymiana informacji w programie Method Validation Pack

Sprz

ę

t i odczynniki

Aparatura

•

Zestaw do wysokosprawnej chromatografii cieczowej składający się z pompy gradientowej, automatycznego
podajnika próbek, termostatu kolumn i detektora UV-Vis [2].

•

Kolumna chromatograficzna ZORBAX Eclipse XDB-C8, dp=5µm, 4.6x150mm [3].

•

Zestaw sterujący zawierający programy ChemStation [4], ChemStore [5] oraz Method Validation Pack [6].

Odczynniki

•

Metanol, do HPLC

•

Woda, Mili-Q

•

Próbka testowa „Isocratic standard” [7] zawierająca 0.15%w/w ftalanu dimetylowego, 0.15%w/w ftalanu
dietylowego, 0.01%w/w bifenylu i 0.03%w/w orto-terfenylu w metanolu.

Metoda analityczna

Oznaczenia zostaną przeprowadzone przy pomocy izokratycznej metody chromatograficznej z detekcją UV-Vis.

•

Faza ruchoma:

metanol + woda (80+30)v/v

•

Przepływ fazy ruchomej:

1.5 ml/min

•

Temperatura:

25ºC

•

Objętość próbki:

5 µl

•

Detekcja:

254/10 nm (jednowiązkowa)

Przebieg

ć

wiczenia

Planowanie walidacji

Zakres badań, jakie podejmuje laboratorium w trakcie walidacji nowej, zmodyfikowanej lub nie stosowanej
dotychczas metody, zależy od istniejącego statusu metody i kompetencji laboratorium. W trakcie walidacji metody
trzeba zdefiniować parametry, granice akceptacji i częstotliwość rutynowych testów przystawalności lub bieżącej
kontroli jakości analitycznej metody. Należy także określić kryteria wskazujące, kiedy metoda jest poza granica
kontroli statystycznej. Laboratorium prowadzące walidacje metody powinno w pełni udokumentować kompletność
procesu walidacji.
W trakcie ćwiczenia pokazany zostanie sposób dołączania elektronicznych wersji dokumentów do raportu z
walidacji generowanego przez program Method Validation Pack. Jako przykładowy dokument zostanie użyty opis
metody chromatograficznej wydrukowany z programu sterującego ChemStation do pliku w formacie pdf.

Identyfikacja pików chromatograficznych

Podstawą działania programu Method Validation Pack jest rozpoznanie pików chromatograficznych związków, dla
których mają być prowadzone testy walidacyjne. W tym celu zostanie przeprowadzona analiza wzorca o
najmniejszym stężeniu (wzorzec 1). Chromatogram z tej analizy będzie podstawą do ustalenia parametrów integracji
i identyfikacji pików chromatograficznych. Szczegółowe instrukcje dotyczące sprzętu i programu poda prowadzący
ć

wiczenie.

•

Należy uruchomić program ChemStation bez podłączenia do bazy danych:

•

Następnie należy wczytać metodę chromatograficzą MV_lab.m, wypełnić dane dotyczące próbki wpisując
katalog Grupa_x i nazwę pliku danych Test_x (gdzie x jest numerem grupy ćwiczeniowej).

•

Otrzymany chromatogram powinien być zbliżony do przedstawionego na rysunku 2.

min

1

2

3

4

5

6

mAU

0

20

40

60

80

100

DAD1 A, Sig=254,4 Ref =550,100 (DEMO\005-0101.D)

0

.7

4

7

1

.0

2

1

2

.5

6

5

5

.8

3

7

Rysunek 2. Typowy chromatogram próbki „isocratic standard”

•

Należy przeprowadzić automatyczny dobór parametrów integracji pików chromatograficznych

Ze wzgl

ę

du na ramy czasowe, w trakcie

ć

wiczenia nie b

ę

d

ą

omawiane sposoby doboru parametrów integracji

i ich wpływ na wyniki ilo

ś

ciowe oznaczenia.

•

Do tabeli kalibracyjnej trzeba wprowadzić nazwy związków i odpowiadające im ilości.

•

Na koniec należy zapisać metodę chromatograficzną pod zmienioną nazwą: File -> Save as... -> Method ->
Grupa_x.m

Utworzenie pliku walidacji w programie Method Validation Pack

Przygotowanie testów walidacyjnych oraz dokumentacji zostanie wykonane w programie Method Validation Pack.
Poniżej opisane są skrótowo niezbędne kroki. Dokładnych wskazówek udzieli prowadzący ćwiczenie.

•

Należy uruchomić program Method Validation Pack podłączając się do bazy danych MV_lab.mdb jako
użytkownik admin (hasło admin).

•

W następnym kroku trzeba utworzyć nową walidację Grupa_x

•

Zaznaczając prawym okiem myszy nazwę walidacji można zmienić jej parametry ogólne. Po pierwsze należy
ustalić, czy wymagany jest podpis elektroniczny zgodnie z normą 21CFR 11? W ramach ćwiczeń to wymaganie
nie będzie stosowane.

•

Do projektu walidacji zostanie dołączony przykładowy dokument zewnętrzny (parametry metody
chromatograficznej wyeksportowane z programu ChemStation). W rzeczywistości powinny to być odpowiednie
dokumenty związane z walidacją, takie jak opis projektu, standardowe procedury operacyjne i inne. Program
Method Validation Pack dołączy je automatycznie do raportu końcowego i będzie przechowywał elektronicznie
powiązania dokumentów. W tym celu należy wybrać kolejno opcje: External Documents -> Add i wybrać z
katalogu Hpchem / 1 /Temp dokument Metoda.pdf.

•

Parametry testów statystycznych stosowanych podczas walidacji można dostosować wybierając opcję
Configuration i odpowiednią zakładkę. W trakcie ćwiczenia będą używane ustawienia domyślne.

•

W oknie dialogowym Properties można również wpisać domyślne nagłówki, które będą obowiązywały dla
całej walidacji, wybierając opcję Default Header Data.

W

ę

zły walidacji

Węzłami walidacji są nazwy związków obecnych w analizowanej mieszaninie, do których będą przyporządkowane
testy walidacyjne. Uwaga: nazwy węzłów muszą ściśle odpowiadać nazwom związków w tabeli kalibracyjnej
walidowanej metody zadeklarowanym poprzednio w programie ChemStation.

•

Węzeł można utworzyć zaznaczając prawym okiem myszy nazwę walidacji i wybierając opcję Add
Component...

•

Po wpisaniu nazwy węzła trzeba wybrać rodzaj testu walidacyjnego, czyli w tym ćwiczeniu Limit of detection /
quantitation

•

W kolejnych krokach można dodać następne węzły.

•

Szczegółowe planowanie każdego testu można rozpocząć po zaznaczeniu tego testu prawym okiem myszy i
wybraniu opcji Planning. W czasie ćwiczenia instruktor zasugeruje sposób wypełnienia pojawiającej się tablicy
dialogowej.

Ustawienia globalne

Przed przystąpieniem do eksportowania zadań z programu Method Validation Pack do programu ChemStation
sterującego sprzętem dobrze jest sprawdzić i skorygować ustawienia globalne dotyczące sposobu traktowania
danych źródłowych oraz wyglądu raportu.

•

Wybierając menu rozwijalne Utilities -> Options oraz odpowiednie zakładki można edytować ogólny sposób
działania programu Method Validation Pack. W trakcie ćwiczenia zostanie sprawdzony i odpowiednio
ustawiony sposób traktowania danych źródłowych w zakładce C/S (ChemStore).

Eksport badania do bazy danych

Ostatnim zadaniem podczas planowania walidacji jest eksport zadań do bazy danych, z której mogą być w
dogodnym czasie wczytane do programu ChemStation.

•

Po wybraniu opcji Create Study and MVS for ChemStation Plus w polu MVS Status uruchomiony zostanie
kreator eksportu badania. Odpowiednie kroki działania tego kreatora zostaną omówione w czasie ćwiczenia.

Import zadania do programu ChemStation

Przed rozpoczęciem wczytywania zadania do programu sterującego ChemStation użytkownik tego programu musi
być podłączony do odpowiedniej bazy danych.

•

W programie ChemStation należy wybrać Database Logon... , wybrać bazę danych MV_lab i wpisać hasło

•

Po podłączeniu do bazy danych można przeprowadzić import sekwencji wygenerowanej w programie Method
Validation Pack

•

Sekwencja jest wykonywana w programie ChemStation, a wyniki są zapisywane w bazie danych.

Import danych do programu Method Validation Pack

Program Method Validation Pack może pobierać wyniki oznaczeń z danych programu ChemStation, importować je
z różnych formatów plików oraz mogą one być wprowadzane ręcznie.
W trakcie ćwiczenia zostanie przeprowadzony:

•

Import danych uzyskanych po wykonaniu sekwencji w programie ChemStation

•

Import danych z pliku w formacie Excel

•

Ręczne uzupełnienie danych

Szczegóły poda prowadzący ćwiczenia
Raport z walidacji metody

W ramach ćwiczenia zostanie pokazany sposób generowania ogólnego lub częściowego raportu z walidacji metody
w programie Method Validation Pack

Literatura

1.

M. Ślebioda, Walidacja metod chromatograficznych, Perlan Technologies (2004)

2.

Agilent Technologies Inc., numer produktu G2184AA

3.

Agilent Technologies Inc., seria 1100

4.

Agilent Technologies Inc., numer produktu 993967-906

5.

Agilent Technologies Inc., numer produktu G2070AA

6.

Agilent Technologies Inc., numer produktu G2181BA

7.

Agilent Technologies Inc., numer produktu 01080-68704

Notatki własne

Ć

WICZENIE 3

W

ALIDACJA METODY ANALITYCZNEJ WYKORZYSTUJĄCEJ

HPLC

dr in

ż

. P. Konieczka

Pan Piotr Konieczka jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
[e-mail]

1.

Na podstawie wyników pomiarów dla krzywej kalibracyjnej (wykorzystując program

Excel) obliczyć:

a.

Wartości średnie wyników dla danego poziomu zawartości wraz z wartościami

odchyleń standardowych, wyniki umieścić w poniższej Tabeli 1.

Tabela 1

Roztwór
wzorcowy/stężenie

Rw 1

Rw 2

Rw 3

Rw 4

Rw 5

Rw 6

Rw 7

1
2

Sygnał

3

Średnia
Odchylenie standardowe
CV, %

b.

Podać wartości powtarzalności

..................................................................................................................................

..................................................................................................................................

c.

Wykreślić krzywą kalibracyjną na podstawie wszystkich punktów pomiarowych

(dane wprowadzić do przygotowanego arkusza).

d.

Przedyskutować liniowość.

....................................................................................................................................

e.

Na podstawie wykresu wyznaczyć wartość niepewności kalibracji dla średniej

wartości stężenia.

..................................................................................................................................

f.

Wykreślić krzywą kalibracyjną na podstawie punktów pomiarowych

odpowiadającym trzem najmniejszym stężeniom (dane wprowadzić do

przygotowanego arkusza).

g.

Wyznaczyć (w oparciu o parametry krzywej kalibracyjnej) wartość LOD na

podstawie odchylenia standardowego:

i.

Wyrazu wolnego s

a

..............................................................

ii.

Resztkowego s

xy

...................................................................

iii.

Dla roztworów wzorcowych o najmniejszym stężeniu ..............................

h.

Podać zakres pomiarowy.

..................................................................................................................................

i.

Otrzymane wartości parametrów walidacyjnych wprowadzić do Tabeli 2.

Tabela .2

Parametr walidacyjny

Wartość

Powtarzalność

Liniowość

LOD

LOQ

Zakres pomiarowy

Niepewność

0

10

20

30

40

50

60

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

Notatki własne

Ć

WICZENIE 2

R

OZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW TECHNICZNYCH W

HPLC. R

ETENCJA

,

S

ELEKTYWNOŚĆ

,

SPRAWNOŚĆ I ROZDZIELCZOŚĆ W UKŁADZIE FAZ

NORMALNYCH

.

Prof. dr hab. in

ż

. M. Kami

ń

ski, mgr in

ż

. G. Romanik

Pan Marian Kamiński jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej

Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;

[e-mail]
Pani Grażyna Romanik jest doktorantką na Studium Doktoranckim przy Wydziale Chemicznym
Politechniki Gdańskiej.

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z najstępującymi zagadnieniami: geneza oraz sposoby
rozwiązywania problemów, spotykanych w praktyce i dotyczących kolumny, dozowania, detekcji, elucji
gradientowej; zasady postępowania w celu doboru warunków rozdzielania w układach NP-HPLC;
metodyka zastosowania chromatografii żelowej (GPC, SEC) do oznaczania rozkładu masy molekularnej
polimerów; obserwacja przebiegu rozdzielania barwnych substancji w kolumnie HPLC.

Streszczenie przebiegu ćwiczenia

1. Zapoznanie Uczestników z alternatywnymi sposobami postępowania, zapewniającymi zapobieganie /
eliminację problemów spotykanych w praktyce i dotyczących:

-

doboru/oceny selektywności, sprawności, rozdzielczości i przepuszczalności kolumny,

-

dozowania bardzo małych i bardzo dużych objętości próbki oraz doboru odpowiedniego
rozpuszczalnika roztworu dozowanego do kolumny,

-

doboru właściwej metody detekcji oraz najkorzystniejszych warunków pracy najważniejszych
detektorów stosowanych w HPLC (UV-VIS, RI, FLD),

-

problemów spotykanych w warunkach elucji gradientowej i sposobów ich eliminacji /
minimalizacji : zanieczyszczenie składników eluentu, obecność rozpuszczonego powietrza w
cieczach stanowiących składniki eluentu, niedoskonałość systemu synchronizacji pracy zaworów
proporcjujących i cyklicznej pracy pompy, nieodpowiednie parametry mieszalnika, „demiksja”
składników eluentu w warunkach programowania składu cieczy eluującej, wytrącanie się
składników próbki w eluencie o niskiej sile elucyjnej i innych.

2. Przykład wpływu składu eluentu na retencję i selektywność rozdzielania: chlorofili i karotenoidów
zawartych w ekstrakcie roślinnym, albo produktów naftowych, albo mieszanin innych substancji nisko i
ś

rednio polarnych (do wyboru przez uczestników grupy) oraz przedstawienie i przedyskutowanie zakresu

zastosowania detektora UV-VIS/DAD do zastosowań jakościowych oraz do określania tzw. „czystości
pików”;

3. Przedstawienie metodyki zastosowania chromatografii żelowej do oznaczenia rozkładu masy
molekularnej polimeru - kalibracja „nisko-dyspersyjnymi” standardami polimeru, a następnie oznaczenie
rozkładu masy cząsteczkowej próbki polimeru (styropian, sztućce, albo fragment obudowy
styropianowej).

4. Wizualna obserwacja przebiegu rozdzielania chlorofili i karotenoidów w kolumnie szklanej w
warunkach NP-HPLC z detekcją UV-254, rejestracją w trybie Y-t. oraz kolekcją frakcji – przykład
preparatywnego zastosowania HPLC w skali „modelowej”.

Materiały, aparatura, oprogramowanie

Składniki eluentu: n-heksan, n-heptan, eter metylowo – tertbutylowy (MTBE), czterowodorofuran (THF),
acetonitryl (ew.), wszystkie o czystości „do HPLC” („HPLC grade”), albo „do elucji gradientowej”
(„gradient grade”);

Próbki i rozpuszczalniki próbek: odwodniony ekstrakt z trawy lub z liści do acetonu, „przeprowadzony”
do rozpuszczalnika o składzie eluentu, albo roztwór oleju napędowego lub nafty w n-heptanie, lub w n-
heksane o stężeniu 0,05g/ml; roztwór polimerów polistyrenowych w THF o stężeniach ok. 0.1 g/ml.

Aparatura i wyposażenie: A) Modułowy chromatograf cieczowy MERCK – HITACHI serii LaChrom
(pompa HPLC, dozownik Rheodyne, kolumna 250x4mm typu CN – 100 7 um, termostat kolumny,
detektor UV-VIS/DAD, detektor RI , interface, komputer, oprogramowanie „HSM”; B) Chromatograf
cieczowy z pompą strzykawkową, dozownik Rheodyne, detektor RI, rejestrator Y-t ; C) Bezpompowy
zbiornikowy moduł zasilania kolumny pod wpływem sprężonego azotu poprzez reduktor ciśnienia, z
dozownikiem membranowym, kolumną szklaną HPLC, detektorem UV-254 i rejestratorem Y-t ; D)
Chromatograf cieczowy serii „Elite” MERCK HITACHI, sterowany komputerem oraz oprogramowanie
rejestracji i przetwarzania danych najnowszej generacji.

Przydatne w praktyce zależności obliczeniowe

1.

Rozdzielczość (R

S

) - uzależnia stopień rozdzielenia substancji od sprawności i selektywności

układu chromatograficznego i jest wyrażona następującym równaniem:

2

2

1

1

4

k

k

N

R

S

+

−

=

α

α

2.

Obliczanie sprawności i innych parametrów na podstawie chromatogramu testowego:

2

2

/

1

)

(

54

,

5

l

S

L

H

C

=

2

2

/

1

)

(

54

,

5

S

l

H

L

N

C

=

=

a

b

As

=

1

,

0

0

t

L

u

C

=

•

Obliczanie sprawności osiągalnej teoretycznie w chromatografii cieczowej niezależnie od
skali rozdzielania – równanie Knoxa

ν

ν

ν

C

A

B

h

teor

+

+

=

33

,

0

, gdzie

p

d

H

h

=

;

M

p

D

ud

=

ν

(dla dobrze wypełnionych i bardzo sprawnych kolumn: A=1, B=2, C=0,1)

Rys. Schemat, przedstawiający chromatogram testowy i sposób wyznaczania parametrów do
obliczenia parametrów sprawności kolumny

Znaczenie symboli:

a, b – część szerokości piku w 0,1 wysokości (patrz rys.)

α

- współczynnik selektywności

As

0,1

– współczynnik asymetrii piku w 0,1 wysokości

A, B, C – stałe dla konkretnej kolumny
D

M

– współczynnik dyfuzji molekularnej substancji rozdzielanej w eluencie

d

p

– średnica ziaren wypełnienia kolumny; wielkość ziaren wypełnienia kolumny

h- tzw. zredukowana wysokość półki teoretycznej
H – wysokość wypełnienia równoważna półce teoretycznej
h

teor

– wartość h otrzymana z równania Knoxa

k

2

– współczynnik retencji substancji później eluowanej

l –

odległość mierzona na chromatogramie ( w warunkach elucji izokratycznej i stałego natężenia

przepływu eluentu)
L

C

– długość wypełnienia kolumny

N- liczba półek teoretycznych
R

S

– stopień rozdzielenia

S

1/2

– szerokość piku w ½ wysokości

t

0

– czas martwy kolumny

u - liniowa prędkość przepływu eluentu w kolumnie

ν

- tzw. zredukowana prędkość przepływu eluentu

Uwagi i zalecenia

Sugeruję, aby Uczestnicy ćwiczenia wykorzystali czas trwania ćwiczenia także dla przedyskutowania z
prowadzącymi i z innymi uczestnikami, problemów, z jakimi spotkali się w swojej praktyce stosowania
HPLC.

Literatura

1.

Chromatografia cieczowa – praca zbiorowa pod redakcją M. Kamińskiego, CEEAM, Gdańsk
2004

2.

Z. Witkiewicz – Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 1995

Notatki własne

Ć

WICZENIE 4.

R

OZDZIELANIA

,

IDENTYFIKACJA I OZNACZANIE ILOŚCIOWE ŚLADOWYCH

ILOŚCI ZWIĄZKÓW POCHODZENIA FARMACEUTYCZNEGO W PRÓBKACH

.

dr in

ż

. A. Kot-Wasik

Pani Agata Kot-Wasik jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
[e-mail]

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest przygotowanie krzywej kalibracyjnej metodą wzorca zewnętrznego i wewnetrzengo
do oznaczenia zawartości fluoksetyny w próbce.

Charakterystyka fluoksetyny

Produkcja, leków, choć tak pożyteczna dla ludzi i zwierząt, może stać się też dla nich zagrożeniem.
Stosowanie ogromnej ilości antybiotyków, hormonów, środków przeciwbólowych czy uspokajających,
stanowi poważny problem w dzisiejszym świecie. Stąd środki farmaceutyczne podawane ludziom są w
dalszej kolejności obecne w mierzalnych stężeniach w wodach powierzchniowych, podziemnych jak
również wodzie pitnej. Korzystanie z wody zanieczyszczonej przez pozostałości farmaceutyków,
spożywanie produktów pochodzenia zwierzęcego zawierających pozostałości śladowe ilości leków, a
także ich metabolitów, zaburza równowagę w organizmie, oraz potęguje problem tak już niebezpiecznego
zjawiska lekooporności.

Do leków antydepresyjnych najnowszej generacji zaliczane są selektywne inhibitory
wychwytu zwrotnego serotoniny. Do leków tych należy m.in. fluoksetyna, którą w
1988 roku wprowadziła na rynek firma Eli Lilly pod nazwą handlową Prozac®. Jedna
kapsułka np.: Prozac®, poza wieloma innymi składnikami, zawiera 20 mg
fluoksetyny.

Oznaczenie chromatograficzne.

Techniki chromatograficzne są typowym przykładem technik opartych na pomiarze względnym czyli
inaczej mówiąc na porównaniu sygnału detektora uzyskanego dla:

•

próbki wzorcowej, w której znane jest stężenie analitu;

•

próbki badanej.

W związku z tym konieczne jest przygotowanie krzywych kalibracyjnych dla wszystkich analizowanych
związków. Krzywe takie wyznacza się w oparciu o analizę próbek wzorcowych.

Analiza jakościowa:

Na podstawie zgodności czasów retencji analitów obecnych w próbce badanej i we
wzorcu

Na podstawie widma UV lub/i MS

Na podstawie zgodności stosunku sygnału dla dwóch różnych długości fal

A

1

A

2

A

1

/A

2

= constans dla danego analitu

Analiza ilościowa

metoda wzorca zewnętrznego

W tym celu należy przygotować szereg rozcieńczeń

analitu, nastrzyknąć do układu chromatograficznego i
wyznaczyć zależność powierzchni piku od stężenia.

A następnie dokonać analizy chromatograficznej i
znaleźć wartość powierzchni piku dla badanego
analitu, po czym obliczyć stężenie (z krzywej
kalibracyjnej y = ax + b lub z proporcji

A/C = A

x

/C

x

gdzie, C

x

= C*A

x

/ A )

Chromatogramy wzorcowych roztworów substancji

o st

ę

ż

eniach róznych st

ę

ż

eniach.

metoda dodatku wzorca

metoda wzorca wewnętrznego

Jest to metoda polegająca na dodaniu do próbki znanej ilości składnika, tzw. wzorca
wewnętrznego (IST), który jest jednak inny od substancji oznaczanych i nie może być obecny
w analizowanych próbkach przed jego dodaniem. W celu uzyskania krzywej kalibracyjnej do
kilku roztworów wzorcowych o różnych stężeniach substancji oznaczanej dodaje się
najczęściej stałą i znaną ilość wzorca wewnętrznego. Na podstawie uzyskanych
chromatogramów roztworów wzorcowych wykreśla się zależność stężenia analitu w funkcji
stosunku powierzchni piku analitu i wzorca wewnętrznego

metoda normalizacji

y = 129,47x - 3,6134

R

2

= 0,9998

0

100

200

300

400

500

600

700

0

1

2

3

4

5

6

St

ę

ż

enie [C]

P

o

le

p

o

w

ie

rz

c

h

n

i

p

ik

u

[

A

]

Warunki analizy chromatograficznej umozliwiaj

ą

cej oznaczenie zawarto

ś

ci fluksetyny

Elementy układu pomiarowego

Rodzaj elementu i parametry pracy

Chromatograf cieczowy

HPLC-UV-DAD, Agilent seria 1100

Składniki fazy ruchomej

A: MeOH (0,1% TFAA) oraz B: H

2

O (0,1% TFAA)

Skład

40% MeOH : 60% H

2

O

Faza ruchoma

Prędkość przepływu

0.5 ml/min

Kolumna

Discovery RP Amide 15cm x 3mm, 5µm

Detektor

UV – 226nm

Wielkość nastrzyku

20µl

Czas trwania analizy

20 min

Przebieg ćwiczenia:

Przygotować roztwór wzorcowy fluoksetyny i maprotyliny o stężeniu 100mg/mL i nastrzyknąć.

W kolbce miarowej o objętości 50 ml umieścić 5 mg wzorca fluoksetyny [FLU] i maprotyliny

[MAP]. Ponieważ oba związki dobrze rozpuszczają się w metanolu, dopełnić kolbkę do kreski

tymże rozpuszczalnikiem, a tym samym otrzyma się wzorzec o stężeniu 100µg/ml.

Po uzyskaniu chromatogramu zidentyfikować związki (na podtsawie czasu retencji i widm UV).

Chromatogram HPLC-DAD-MS uzyskany w trakcie analizy roztworu wzorcowego fluoksetyny

(maprotylina

jest tutaj wzorcem wewn

ę

trznym) wraz z widmami UV i MS.

220 240 260 280

300 320

340 360 380

mAU

0

50

100

150

200

250

DAD1, 9.541 (0. 6 mAU, Bln) of CHECKV15.D

DAD1, 12. 074 (1.0 mAU, - ) of CHECKV15.D

DAD1, 10. 474 (291 mAU, - ) of CHECKV15.D

Długo

ś

ć

fali [nm]

A

220

240 260 280 300 320

340 360 380

mAU

0

100

200

300

400

500

600

DAD1, 6.034 (1.5 mAU, - ) of CHECKV15.D

DAD1, 7.981 (4.1 mAU, - ) of CHECKV15.D

DAD1, 6.714 (686 mAU, - ) of CHECKV15.D

Długo

ś

ć

fali [nm]

B

Sporządzenie rozcieńczeń roztworu wzorcowego fluoksetyny i maprotyliny (wzorzec

wewnętrzny;

Metodą serii rozcieńczeń w kolbkach o pojemności 10 ml wyposażonych w nakrętki z

tworzywa sztucznego przygotować roztwory wzorcowe o stężeniach: 30, 20, 10, 5, 2, 0.7,

0.3, 0.2, 0.02, 0.001 µg/ml. Z tak przygotowanych próbek do chromatografu cieczowego

wprowadzić po 20µl każdego roztworu.

Nastrzyknąć ( 3 razy) roztwór wzorcowy o najwyższym stężeniu;

Nastrzyknąć (3 razy) roztwór o niższym stężeniu;

Potraktować tą analizę jako analizę próbki i policzyć stężenie na podstawie jednego punktu (z

analizy pierwszej); zastanowić się nad źródłami błędu;

Na podstawie analizy nr 1 oraz analizy nr 2 narysować krzywą kalibracyjną; określic jej

parametry;

Nastrzyknąć mieszaninę o trzecim stężeniu (3 razy) traktując ją jako analizę próbki i policzyć

stężenie na podstawie dotąd otrzymanych wyników; zastanowić się nad źródłami błędów;

Uzupełnić krzywą kalibracyjną o kolejny punkt;

Powtórzyć schemat postępowania aż do uzyskania 5-7 punktowej krzywej kalibracyjnej;

Krzywa wzorcowa dla fluoksetyny otrzymana na podstawie analiz z wykorzystaniem detektora DAD

Wyznaczyć stężenie fluoksetyny w roztworze o nieznanym stężeniu.

Notatki własne

Wszelkie prawa zastrze

ż

one. Nieautoryzowane rozpowszechnianie cało

ś

ci lub fragmentów

niniejszych materiałów jest zabronione. Utwór nie mo

ż

e by

ć

powielany ani rozpowszechniany

za pomoc

ą

urz

ą

dze

ń

elektronicznych, mechanicznych, kopiuj

ą

cych, nagrywaj

ą

cych i innych bez

pisemnej zgody posiadacza praw autorskich. Wykonywanie kopii jak

ą

kolwiek metod

ą

powoduje

naruszenie praw autorskich do niniejszej publikacji.