Wykład 7

Ekspresja genów, biosynteza białka,

metody biotechnologiczne stosowane

w gospodarce żywnościowej

Ekspresja genów

2

wd_7

Definicja genu

wd_7

3

Struktura genów prokariotycznych

wd_7

4

Promotor

Sekwencja
odpowiadająca
za wiązanie
rybosomu

Właściwa sekwencja

kodująca

Terminator
(transkrypcji)

5’

3’

Miejsce
inicjacji
transkrypcji

Sygnał
START dla
translacji

Sygnał
STOP dla
translacji

DNA

Struktura genów eukariotycznych

wd_7

5

rejony kodujące

(eksony)

rejony niekodujące

(introny)

gen eukariotyczny

DNA

5’

3’

5’

3’

promotor

Miejsce
inicjacji
transkrypcji

Miejsce
terminacji
transkrypcji

kodony stop:

UAA, UGA, UAG

kodon „start” -

koduje

metioninę

:

AUG

6

wd_7

Replikacja DNA w komórkach

eukariotycznych

7

wd_7

8

wd_7

Replikacja DNA w komórkach

eukariotycznych cd

wd_7

9

W procesie

replikacji

stwierdzono wiele aktywności enzymatycznych:

Topoizomeraza

– rozplata podwójną helise DNA, umożliwiając

rozpoczęcie procesu;

helikaza

- rozrywają wiązania wodorowe między nićmi matrycowego

DNA, rozdzielające je;

prymaza

- syntetyzuje starter – odcinek RNA;

polimerazy DNA

– syntetyzują DNA, wytwarzają wiązania fosfodiestrowe,

zgodnie z zasadą komplementarności;

egzonukleaza

- usuwa startery RNA z nici;

ligaza DNA

- uzupełnia brakujące wiązania fosfodiestrowe w szkielecie

nowozsyntezowanej nici DNA – łączy fragmenty Okazaki;

10

wd_7

Transkrypcja u

eukariotów

11

wd_7

nić sensowna

nić antysensowna

2. elongacja

– polimeraza RNA syntetyzuje RNA w kierunku 5’→3’

używając 5’-trifosforanów jako substraty Kolejne zasady dobudowywane
są na podstawie komplementarności zasad (szybkość 50-100 zasad/sek),
zamiast

tyminy występuje uracyl

!

12

wd_7

Transkrypcja u eukariotów cd

3. terminacja

– transkrypcja trwa

A

C

G U

C

C

C

C

C

C

A

A

A

A

A A

G

G

G G

G

U

U

U

RNAP

5’

wd_7

13

3. terminacja

– transkrypcja trwa

do momentu, gdy kompleks
transkrypcyjny napotka sygnał
terminacji np. palindromowy
rejon bogaty w GC w efekcie RNA
przybiera postać

struktury spinki od

włosów

innym sposobem terminacji jest

białko rho

, które rozpoznaje

miejsca terminacji i kończy
tarnskrypcję

5’
mRNA

Sekwencja
terminacyjna

RNAP

Rho

ATPaza

zatrzymanie

Dojrzewanie mRNA u eukariotów:

Synteza blokady

(kapu)

na końcu 5’ –

przyłączenie

7-metyloguanozyny (m7G),

kap zabezpiecza koniec 5’ transkryptu przed

atakiem rybonukleaz oraz pełni rolę przy

biosyntezie białka –

tylko mRNA ma kap –

rRNA i tRNA kapu nie posiadają

Poliadenylacja

końca 3’

– dołączenie nawet

Poliadenylacja

końca 3’

– dołączenie nawet

do 500 reszt A – powstaje

ogon poly(A),

sekwencja ta stabilizuje mRNA ułatwia

tworzenie kompleksu z odpowiednimi

białkami i

utrudnia atak rybonukleazom

Splicing

– usunięcie

sekwencji intronowych

i

połączenie

sekwencji eksonowych

w

funkcjonalną cząsteczkę mRNA,

katalizowanie

przez snRNA – możliwy

alternatywny splicing

Redagowanie RNA

-

polega na insercji lub

delecji nukleotydów oraz na deaminacji

nukleozydów (C

→

U) – nie u wszystkich

organizmów

14

wd_7

wd_7

15

Biosynteza białka u eukariotów

16

wd_7

Aminoacylo – tRNA: aktywowane związki

pośrednie w biosyntezie białka

1 etap

2 etap

Dwuetapowa synteza aminoacylo-tRNA

17

wd_7

3 etapowa biosynteza białka - powstawanie wiązania

peptydowego pomiędzy aminokwasami

P- miejsce peptydylowe, A – miejsce aminokwasowe na rybosomie

18

wd_7

19

wd_7

Biosynteza białka - podsumowanie

20

wd_7

Obróbka potranslacyjna białka

21

wd_7

Kontrola ekspresji genów

22

wd_7

Operon laktozowy

brak laktozy

laktoza

Laktoza + H

2

O

→

→

→

→ galaktoza + glukoza

enzym:

ββββ

-galaktozydaza

laktoza

23

wd_7

Metageneza, uszkodzenia i naprawa DNA

24

wd_7

Delecja

wd_7

25

Mechanizm delecji na poziomie

całego chromosomu

Insercja

wd_7

26

Mechanizm insercji na poziomie

całego chromosomu.

Mutageny

Metyzacja guanidyny w DNA
przez dichlorfos (substancja
czynna insektycydów
fosforoorganicznych):

27

wd_7

28

wd_7

Naprawa DNA

29

wd_7

Elementy inżynierii molekularnej

30

wd_7

Enzymatyczny rozkład kwasów

nukleinowych.

Działanie DNAazy II na cząsteczkę DNA

31

wd_7

5’ GGTACCAATTCAAAGCTTATG 3’

3’ CCATGGTTAAGTTTCGAATAC 5’

Enzymy restrykcyjne – rozcinanie DNA w

specyficznych miejscach

Alu I

Hind III

A

↓↓↓↓

AGCTT

TTCGA

↑↑↑↑

A

5’ GGTACCAATTCA

A

3’

3’ CCATGGTTAAGT

TTCGA

5’

5’

AGCTT

ATG 3’

3’

A

TAC 5’

Alu I

AG

↓↓↓↓

CT

TC

↑↑↑↑

GA

5’

CT

TATG 3’

3’

GA

ATAC 5’

5’ GGTACCAATTCAA

AG

3’

3’ CCATGGTTAAGTT

TC

5’

tępe końce

lepkie/wystające końce

32

wd_7

5’ GGTACCAATTCA

A

||||||||||||||||||||

3’ CCATGGTTAAGT

TTCGA

AGCTT

ATG 3’

|

A

TAC 5’

5’ GGTACCAATTCA

A

||||||||||||||||||||

3’ CCATGGTTAAGT

TTCGA

AGCTT

ATG 3’

|

A

TAC 5’

Hind III

A

↓↓↓↓

AGCTT

TTCGA

↑↑↑↑

A

Hind III

5’ GGTACCAATTCA

A

3’

5’

AGCTT

ATG 3’

5’ GGTACCAATTCA

A

3’

|||||||||||||

5’

AGCTT

ATG 3’

|||

Enzymy restrykcyjne – zastosowanie

5’ GGTACCAATTCA

A

|||||||||||||

||||

|||

3’ CCATGGTTAAGT

TTCGA

AGCTT

ATG 3’

|

A

TAC 5’

|||||||||||||

3’ CCATGGTTAAGT

TTCGA

5’

5’

AGCTT

ATG 3’

|||

3’

A

TAC 5’

|||||||||||||

3’ CCATGGTTAAGT

TTCGA

5’

|||

3’

A

TAC 5’

ligaza

33

wd_7

5’ GGTACCCGGGCAA

||||||||||||||||||||

3’ CCATGGGCCCGTTTCGA

AGCTTATG 3’

|

ATAC 5’

5’ GGTACCAATTCAA

||||||||||||||||||||

3’ CCATGGTTAAGTTGGCC

CCGGTATG 3’

|

ATAC 5’

Xma I

A

↓↓↓↓

CCGGT

TGGCC

↑↑↑↑

A

Age I

C

↓↓↓↓

CCGGG

GGGCC

↑↑↑↑

C

5’ GGTACCAATTCAA 3’

5’CCGGTATG 3’

5’ GGTAC 3’

Enzymy restrykcyjne – zastosowanie

ligaza

5’ GGTACCAATTCAA 3’

|||||||||||||

3’ CCATGGTTAAGTTGGCC 5’

5’CCGGTATG 3’

||||

3’ATAC 5’

5’ GGTAC

CCGG

T

ATG

|||||||||||||

3’ CCATG

GGCC

A

TAC

3’

5’

C

↓↓↓↓

CCGGG

GGGCC

↑↑↑↑

C

A

↓↓↓↓

CCGGT

TGGCC

↑↑↑↑

A

Xma I

Age I

5’ GGTAC 3’

|||||

3’ CCATGGGCC 5’

5’CCGGGCAAAGCTTATG 3’

||||||||||||

3’CGTTTCGAATAC 5’

34

wd_7

Cykl syntezy DNA w reakcji PCR

35

wd_7

Reakcja PCR - mieszanina reakcyjna

dwuniciowa
matryca DNA

sekwencja docelowa

bufor

dNTP

starter1

starter2

polimeraza Taq

36

wd_7

94°C

15s

94°C

3 min

te

m

p

er

at

u

ra

15x

1x

1x

94°C

15s

94°C

3 min

te

m

p

er

at

u

ra

15x

1x

1x

Profil termiczny reakcji PCR

65°C

15s

72°C

30s

czas

72°C

30s

4°C

±∞

65°C

15s

72°C

30s

czas

72°C

30s

4°C

±∞

cykl

podstawowy

cykle dodatkowe

37

wd_7

Zastosowanie metody PCR

38

wd_7

wektor

trawienie enzymem restrykcyjnym

DNA zawierający
wstawkę,
którą chcemy
przeklonować

trawienie

enzymem

restrykcyjnym

wstawka

Klonowanie DNA

ligacja wektora
ze wstawką

plazmid ze wstawką gotowy

do wprowadzenia do bakterii

39

wd_7

Pozytywne aspekty GMO

40

wd_7